В современных экономических условиях огромное значение приобретает производство высококачественной сельскохозяйственной продукции, в том числе свинины. Реализация данной задачи возможна только при наличии высокого генетического потенциала животных, формирующегося непрерывной селекционной работой.
К наиболее перспективным направлениям в современной селекции сельскохозяйственных животных относятся биотехнологические исследования, включая ПЦР-анализ полиморфизма генов, так или иначе сопряженных с хозяйственно полезными признаками и жизнеспособностью животных [3].
Изучению стрессов у свиней, их генетической сущности и селекции на устойчивость к неблагоприятным факторам посвящены многие работы [2, 7].
Из всех факторов, связанных с технологическими процессами, особенно сильным и неизбежным стрессом является отъём поросят от матерей. Ранний отъём поросят, применяемый в промышленной технологии, приводит к высокому их падежу (0,4–0,5 %), так как после отъёма возникает сильная стресс-реакция, в результате которой образуются язвы на слизистой желудочно-кишечного тракта [1].
Длительные стрессовые ситуации приводят к тахикардии, очаговому цианозу кожи, повышению температуры тела до 42–45 °С и молочному ацидозу [8]. При прогрессировании патологического процесса развивается тахикардия с последующей остановкой сердца в результате резкой гиперкалиемии на фоне гипоксии и метаболических нарушений [9]. После убоя таких животных проявляется синдромы бледной, мягкой, экссудативной PSE (Pale Soft Exudative) или тёмной, жёсткой, сухой свинины DFD (Dark Firm Dry). Было показано, что столь серьёзный дефект связан с аномальным изменением рH cкелетной мускулатуры после убоя [10].
Как метод прогнозирования стресс-чувствительности свиней используют тесты, характеризующие высшую нервную деятельность, креатинкиназный тест, метод «кризис отъема», метод локального адаптационного синдрома, содержание в шпике линоленовой кислоты, реакция на этанол.
Проблема стрессов в свиноводстве стоит особенно остро, так как при промышленной технологии их избежать невозможно. Поэтому исследования, связанные с выявлением свиней, устойчивых к стрессу, остаются актуальными. Доказано, что чувствительность к стрессам – наследственно обусловленный порок свиней, который чаще всего выявляется у свиней мясных пород. ПЦР-ПДРФ анализ позволяет выявлять всех носителей мутантного гена и выводить их из селекционного процесса, что обеспечивает более высокую сохранность поросят.
Исследования проведены в хозяйстве – оригинаторе по чистопородному разведению кемеровского заводского типа мясных свиней КМ-1 – ООО СХО «Заречье» Кемеровской области, лаборатории биотехнологии СибНИПТИЖ СО РАСХН.
Объектом исследований явились хряки-производители, свиноматки, поросята группы 0-2, ремонтный молодняк и подсвинки на контрольном откорме.
Полиморфизм структурных генов выявляли с помощью реакции ПЦР. Выделение ДНК проводили по методике, предложенной лабораторией «Медиген». Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в объеме 25 мкл. Исследования полиморфизма гена RYR-1 проводили по методике, описанной Калашниковой и др. [6]. Для выявления гена RYR-1 применяли два олигонуклеотидных праймера:
RYR 56: 1 5’-GTGCTGGАTGTCCTGTGT TCCCT – 3’
RYR 56: 2 5’-GTGGTGACATAGTTGATGAGG TTTG – 3’
Режим амплификации: «горячий старт» – 94 °С – 6 мин; денатурация – 94 °С – 1 мин., отжиг – 60 °С – 1 мин, элонгация – 72 °С – 1 мин; достойка матрично-праймерных комплексов проводится при 72 °С – 5 мин.
Концентрацию и специфичность амплификата оценивают электрофоретическим методом в 2 % агарозном геле. Визуализируется амплифицированный фрагмент RYR-1 с помощью трансиллюминатора в проходящем УФ – свете. Длина амплифицированного фрагмента составляет 134 п.н. Полученный фрагмент подвергали рестрикции рестриктазой Hin6I c соответствующим буфером.
Наличие на геле двух полос длиной 84 п.н. и 50 п.н. соответствовало гомозиготному генотипу NN; одной яркой, чёткой полосы и двух менее ярких длиной 134, 84,50 п.н. – гетерозиготный генотип Nn; одной яркой длиной 134 п.н. – гомозиготный генотип – nn.
Полимеразную цепную реакцию для выявления полиморфизма гена ESR F18/FUTI проводили с использованием следующей методики. После начальной денатурации при температуре 95 °С в течение 5 минут выполняли 35 циклов амплификации в следующем температурном режиме: 95 °С – 1 мин., 66 °С – 1 мин., 72 °С – 1 мин. Для амплификации фрагмента гена ESR F18/FUTI использовали праймеры ESR 1 и ECR 2
ESR 1–5’ CGC CAC CTC TGT CTG ACC TT – 3’
ESR 2–5’ AGG AGC GTG CCT GTC TAC CTC – 3’
Полученный амплификат подвергали гидролизу с рестриктазой BSTHH I с последовательностью узнавания GCG↓C. Отсутствие рестрикционного сайта соответствует аллелю А, в то время как его наличие – аллелю G.
Для анализа амплифицированных фрагментов ДНК и продуктов рестрикции использовали метод гель-электрофорез. Электрофоретическое разделение проводили при 120–135 В в 1,8–2 %-ном агарозном геле в буфере ТАЕ.
Полученные фрагменты, согласно методике соответствовали:
378 п.н. – АА, 291 и 87 п.н. – GG, 378, 291 и 87 – AG.
Исследованиями как отечественных, так и зарубежных учёных установлено, что более чувствительны к стрессам свиньи пород пьетрен и ландрас и менее подвержены стрессам свиньи крупной белой, йоркшир, дюрок. Исследования, проведенные на современном молекулярном уровне показали, что из 87 животных заводского типа КМ-1 частота мутации в гене RYR-1 составляет 0,0057 (табл. 1).
Таблица 1
Структура популяций свиней по локусу RYR 1
|
Популяция |
n |
Частота генотипов RYR1 |
Частота мутантного гена RYR 1n |
||
|
N/N |
N/n |
n/n |
|||
|
КМ-1 |
87 |
0,989 |
0,0114 |
0 |
0,0057 + 0,0001 |
|
СМ-1 [27] |
113 |
0,912 |
0,088 |
0 |
0,046 + 0,0002 |
Это означает, что при чистопородном разведении заводского типа КМ-1 по ряду количественных признаков сформирована уникальная в отношении стрессустойчивости популяция животных.
Не менее важной проблемой в свиноводстве остается сохранение молодняка, причиной гибели которого чаще всего бывает диарея. Как известно, возбудителем заболевания является кишечная палочка E.colli. Наряду с вакцинацией маток, в настоящее время разработан метод анализа вариантов гена ESRF18/FUT1, носители некоторых генотипов которого обладают более высокой устойчивостью к колибактериозу. Нашими исследованиями установлено, что генотип АА у свиней заводского типа КМ-1 встречается в 5 раз меньше, чем генотип GG, а аллель А в два раза меньше, чем альтернативный G (табл. 2). Около половины животных имеют гетерозиготный генотип AG.
Таблица 2
Генотипическая структура свиней КМ-1 по гену ESR
|
Генотип |
n |
Частота генотипа наблюдаемая, % |
Частота генотипа ожидаемая, % |
Частота аллеля |
χ2 |
|
AA |
4 |
8,0 ± 3,83 |
10,2 ± 4,28 |
А – 0,32 |
1,06 |
|
AG |
24 |
48,0 ± 7,06 |
43,5 ± 7,01 |
G – 0,68 |
|
|
GG |
22 |
44,0 ± 7,01 |
46,2 ± 7,05 |
Устойчивость или чувствительность к колибактериозу может оказывать влияние на проявление хозяйственно полезных признаков, особенно на сохранность поросят.
Установлено, что наличие генотипов гена ЕSRF18/FUТ1 не оказало влияния на изучаемые показатели свиноматок, за исключением сохранности поросят в гнезде к отъёму (табл. 3). У животных с генотипом AG сохранность поросят была выше на 10,1 % (Р < 0,01), чем у носителей генотипа GG.
Таблица 3Продуктивность свиноматок с учётом генотипов гена ESRF18/FUT1
|
Показатель |
Генотип |
|
|
GG |
AG |
|
|
Возраст достижения 100 кг, дней |
176,2 ± 2,80 |
181,1 ± 2,61 |
|
Толщина шпика, мм |
23,0 ± 0,86 |
23,0 ± 0,54 |
|
Длина туловища, см |
125,9 ± 0,69 |
126,4 ± 0,67 |
|
Многоплодие, гол. |
10,1 ± 0,58 |
10,2 ± 1,22 |
|
Молочность, кг |
54,6 ± 3,05 |
56,9 ± 2,30 |
|
Масса гнезда в 2 месяца, кг |
188,4 ± 7,46 |
196,4 ± 6,21 |
|
Масса 1 поросёнка в 2 месяца, кг |
22,6 ± 1,01 |
22,6 ± 0,93 |
|
Сохранность, % |
82,1 ± 2,32 |
92,0 ± 2,96** |
Аналогичные исследования по влиянию генотипов гена ESRF18/FUT1 на продуктивность хряков указывают на то, что гетерозиготные хряки с генотипом AG, устойчивые к колибактериозу, имели более высокую энергию роста и достигали 100 кг на 13,6 дней раньше (Р < 0,01), чем производители с альтернативным генотипом, где присутствует нежелательный аллель G (табл. 4).
Продуктивность хряков с учётом генотипов гена ESRF18/FUT1
|
Показатель |
GG |
AG |
|
Возраст достижения 100 кг, дней |
179,7 ± 2,74** |
166,1 ± 2,26 |
|
Толщина шпика, мм |
21,6 ± 1,25 |
19,5 ± 0,65 |
|
Длина туловища, см |
129,6 ± 0,88 |
130,5 ± 1,37 |
|
Многоплодие, гол. |
8,9 ± 0,44 |
8,6 ± 0,48 |
|
Масса 1 поросёнка, кг |
22,1 ± 0,47 |
22,5 ± 0,59 |
В свиноводстве за рубежом широко используется анализ на наличие нежелательной мутации в гене RYR-1, ответственной за предрасположенность животных мясных пород к злокачественной гипертермии.
Исследователями отмечено, что селекция свиней на улучшение мясных качеств приводит к снижению устойчивости к стрессам. По данным Н.А. Зиновьевой, более устойчивы к стрессу свиньи крупной белой породы [5]. Частота мутаций в этой породе находится в пределах 3,6–8,2 %. Незначительное количество животных с мутацией этого гена обнаружено у свиней породы СМ-1 (5,3 %), [4] в то же время у свиней крупной чёрной она выявлена у 13,6 % животных. Хорошей устойчивостью к стрессам характеризуется ливенская порода. В породе СМ-1 в смежных поколениях зафиксирована единичная встречаемость гетерозиготных носителей мутации и полное отсутствие гомозигот по рецессивному аллелю.
Проведённые исследования показали что, c целью планирования селекционного процесса, контроля стрессустойчивости и здоровья животных, а также максимального использования производителей, имеющих лучшее сочетание у потомства селекционируемых и других хозяйственно полезных признаков, таких как высокая скороспелость и конверсия корма, тонкий шпик необходимо осуществлять генетический мониторинг в популяциях племенных хозяйств по свиноводству с использованием ген маркёров – RYR-1n и ESRF18/FUT1.