Одними из источников получения иммуностимулирующих препаратов являются продукты метаболизма некоторых микроорганизмов. Так, например, в научно-внедренческом центре Игнатова созданы препараты Достим и Мастим, основой для получения которых послужили некоторые виды дрожжей [2, 3].
Из культуры микроскопического гриба Strеptococcus griseus получен биологически активный препарат ПЭФАГ, представляющий собой комплекс липидов этого микроба, обладающий высокой биологической активностью [4, 5].
Рядом исследователей установлено влияние полисахаридного комплекса, выделенного из актиномицетов на образование антител в организме животных и повышение их естественной резистентности к инфекционным заболеваниям [6, 7].
В связи с этим целью настоящей научной работы являлся поиск естественного, экологически безопасного источника биологически активных веществ, для последующего создания препарата – иммуностимулятора.
Материалы и методы исследования
Работа проводилась на базе НИИСХ Северо-Востока, г. Киров. Для получения целевого объекта исследовали штаммы грибов, выделенные с листьев ячменя пораженных грибом Drechslera (D) graminea. Экспериментальным путем подбирали оптимальную питательную среду для культивирования D. graminea.
Изыскание безвредного для теплокровных животных штамма микромицета и культивирование выделенных с растительного материала чистых культур грибов, осуществляли на агаре Чапека и жидкой питательной среде по общепринятой методике. Отобранный штамм культивировали в термостате на жидкой питательной среде (модификации среды Чапека) для получения культуральной жидкости (КЖ). Аминокислотный состав мицелия гриба и КЖ определяли на аминокислотном анализаторе ААА-Т-339, триптофан на ФЭКе. Общий азот определяли по Къельдалю, фосфор с ванадатмолибдатным реактивом, калий с помощью пламенной фотометрии на пламенном фотометре ПАЖ-1, кальций и магний определяли трилонометрическим методом, содержание сахара устанавливали общепринятыми тестами.
Испытание КЖ гриба осуществляли на беспородных белых мышах в возрасте 30 дней, основываясь на методических указаниях Билай В.И и Курбацкой З.А. [1]. Животных распределяли на 4 группы по 10 мышей в каждой. Две группы мышей – контрольные (№ 1 и № 2) и две – опытные на введение культуральной жидкости (№ 3, 4). В качестве плацебо использовалась дистиллированная вода, используемая для приготовления жидкой питательной среды (группа № 5). Основным контролем служила жидкая питательная среда. В обоих вариантах жидкости инъецировали в дозе 0,5 мл/мышь.
В опытных группах КЖ вводили однократно, подкожно: в 3-ей – 0,2 мл, 4-ой – 0,3 мл и 5-ой – 0,5 мл. Наблюдения за состоянием мышей вели в течение 10 суток, после чего животных взвешивали. Статистическую обработку проводили, используя критерий Стьюдента, считая результат достоверным при Р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В процессе изыскания подходящей среды испытаны 10 различных питательных сред, из которых отобрана оптимальная. Эта среда представляет из себя модификацию среды Чапека, которая стерилизовалась в автоклаве при 0,5 атмосфер в течение 30 мин. Культивирование гриба D. graminea осуществлялось при температуре 25 °С в течение 30 дней.
Определение некоторых химических характеристик веществ, входящих в КЖ и мицелий гриба выявило следующее. В мицелии гриба, выращенном на жидких средах в составе аминокислот доминирующими являются: аспарагиновая, глутаминовая и аргинин с фенилаланином, на долю которых приходится 45 % от всей суммы аминокислот. Аналогичным образом представлена картина аминокислот и в КЖ, однако, концентрация этих четырех аминокислот занимает не менее 50 % от всех суммарно представленных аминокислот. Содержание аминного азота в образцах КЖ, автоклавированной при 0,5 атмосферах в течение 30 минут, составляет к общему азоту до 70 %. Из минеральных элементов основу мицелия гриба составляют фосфор, калий и магний. В культуральную жидкость переходит больше калия и кальция (на 30-й день культивирования). В КЖ основу составляли сахара до 41 % и сырой протеин до 57 % в пересчете на сухое вещество.
Установлено, что подкожное введение КЖ в объеме 0,2 мл, 0,3 мл и 0,5 мл белым мышам не вызывает их гибели либо отклонений в клиническом состоянии. Данные приведены в таблице.
Влияние КЖ гриба D. graminea (штамм Н-95) на белых мышей при парентеральном введении (n = 10 в группе)
|
Группа / nn |
Доза, введенная одной мыши (мл) |
Масса тела (г) |
Выжило мышей |
||
|
до опыта |
по окончании опыта |
голов |
% |
||
|
1. Контроль (питательная среда) |
0,5 |
17,9 ± 0,2 |
19,0 ± 0,1 |
10 |
100 |
|
2. Опыт (КЖ) |
0,2 |
18,5 ± 0,15 |
23,0 ± 0,2* |
10 |
100 |
|
3. Опыт (КЖ) |
0,3 |
18,1 ± 0,3 |
21,5 ± 0,5* |
10 |
100 |
|
4. Опыт (КЖ) |
0,5 |
18,2 ± 0,5 |
18,5 ± 0,25 |
10 |
100 |
|
5. Контроль (плацебо) |
0,5 |
18,0 ± 0,2 |
18,5 ± 0,3 |
10 |
100 |
Примечание. * – Р < 0,05 в сравнении с исходными данными.
Как видно из результатов, приведенных в таблице, введение КЖ в дозе 0,2 и 0,3 мл/мышь вызывает достоверное (Р < 0,05) увеличение массы тела на 18–24 % соответственно. Однако, более высокая доза (0,5 мл/мышь) не влияет на изменение весового показателя (Р > 0,05).
Штамм Н-95 гриба D. graminea, на основании атоксичных свойств, был отобран для дальнейшей работы. Индуцированный автолиз мицелия гриба не выявил повышения стимулирующей активности КЖ.
Выводы
В результате проведенных исследований на беспородных белых мышах отобран безопасный для теплокровных штамм гриба D. graminea. Определены оптимальные условия его культивирования и установлен химический состав культуральной жидкости и мицелия.