Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,564

VIRULENCE FACTORS OF ENTEROCOCCI

Mironova A.V. 1
1 The Pacific State Medical University
For many years enterococci were not considered as clinically significant causative agents of infectious pathologies [1, 2, 3]. However, they came to be detected in the clinical material of various pathological conditions in increasing frequency. The review of the aetiological significance of enterococci has allowed revealing such factors of their pathogenicity as haemolytic, proteolytic, and adhesion properties. The ability of enterococci to acquire tolerance to many antimicrobial drugs and spread it quickly is of particular importance [4, 5, 6]. The emergence and spread of antimicrobial resistance of enterococci, which appeared due to the selective impact of antibiotics on a normal micro flora in a course of intensive, and often irrational, antibiotic therapy, is a serious clinical and ecological problem [7, 8].
inflammatory diseases of pelvic organs
enterococcal infection

В настоящее время установлено, что вирулентность микроорганизма регулируется генами, кодирующими вирулентность, находящимися в особых регионах генома, которые именуются островками патогенности (pathogenicity islands, PAI) [9]. PAI энтерококка были впервые идентифицированы в геноме мультирезистентного к антибиотикам штамма E. faecalis [MMH594], который был причиной вспышки внутрибольничной инфекции в 1980-х годах [10]. Размер гена энтерококка составляет около 150 Кб и кодирует до 129 открытых рамок считывания (ORF).

Поразительная особенность была выявлена путем сравнения последовательностей, составляющих PAI в штамме MMH594 между V583 и V586 [11]. Была обнаружена способность модулировать вирулентность организма путем селективного удаление конкретных островков патогенности. Сравнение между подвидами ванкомицин-резистентных энтерококков также выявило высокую степень идентичности последовательностей PAI за исключением присутствия или отсутствия отдельных элементов. Способность к изменениям подобного рода позволяет энтерококку перемещаться в различные биотопы хозяина, вызывая развитие патологического процесса [12]. Однако такие способности – далеко не единственный фактор вирулентности энтерококков. Ряд исследований [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20] определили различные факторы вирулентности, наиболее важными из которых являются гемолизин, желатиназа, энтерококковый поверхностный белок (ESP), агрегативная субстанция (AS), Асе MSCRAMM, капсульные полисахариды и углеводы клеточной стенки бактерий, супероксид.

Гемолизин – цитолитический белок, способный лизировать эритроциты человека, лошади и кролика. Гемолизин продуцируют штаммы энтерококка, которые продемонстрировали высокую вирулентность в экспериментальных исследованиях у животных и в клинических условиях у человека [5, 21, 22], продукция гемолизина ассоциируется с повышением тяжести инфекционного процесса [23]. Гемолизин выявляется при посеве энтерококка на питательный агар на основе бульона из говяжьего сердца с добавлением 5 % крови лошади. Чашки Петри инкубируются в СО2 камере при температуре в 37 °С с контролем через 24 и 48 часов. Четкая зона гемолиза вокруг колоний микроорганизмов позволяет говорить о наличии гемолизина [24]. Экспрессия гемолизина или цитолизина определяется двухкомпонентной регулирующей системой через кворум-чувствительный механизм [19].

Желатиназа – протеаза, продуцируемая энтерококками, которая способна гидролизовать желатин, коллаген, казеин, гемоглобин и другие пептиды [25]. Было показано, что желатиназа, продуцируемая штаммами E. faecalis , отвечает за вирулентность микрпоорганизма при экспериментальном эндокардите у животных [26]. Способность продуцировать желатиназу в лабораторных условиях может быть выявлена при посеве энтерококков на среду из свежеприготовленного пептон-дрожжевого экстракт-агара, содержащего желатиновые пластинки. Чашки Петри инкубируют при 37 °С в течение ночи, затем охлаждают до комнатной температуры в течение двух часов. Наличие зон гало вокруг колоний свидетельствует о положительном результате [24, 27].

Энтерококковый поверхностный белок (Enterococcal surface protein [ESP] – это связанный с клеточной стенкой микроорганизма протеин, чаще обнаруживаемый у штаммов, перешедших в патогенную форму, чем у сапрофитных энтерококков (18). ПЦР амплификация гена ESP может быть выполнена при помощи праймеров ESP11 (5’-TTGCTAATGCTAGTCCACGACC-3’) и Esp 12 (5’-GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA-3’), которые соответствуют нуклеотидным позициям 1217-1238 и 2149-2171 соответственно, внутри N-терминала Esp (24). Микст для ПЦР реакции состоит из 250 нг DNA; по 0.2 µL dATP [2’-диоксиаденозин 5’-трифосфат], dCTP [2’-диоксицитозин 5’-трифосфат], dGTP [2’-диоксигуанозин 5’-трифосфат], and dTTP [2’-диокситимидин 5’-трифосфат]; 2.5 mM MgCl2; и 2.5 U AmpliTaq DNA полимеразы в 1 x реакционном буфере (24).

Образцы проходят инициальную денатурацию при 95 °С в течение двух минут и подвергаются 30 циклам денатурации [94 °С в течение 45 с], отжига [63 °С в течение 45 секунд] и расширения [72°C в течение одного мин]. Пять микролитров амплификационной смеси должны быть смешаны с загрузочным буфером гель и подвергали электрофорезу в один процент агарозном геле. Продукты реакции могут быть визуализированы с помощью окрашивания бромидом этидия. ДНК из культуры E. faecalis MMH594 и FA2-2 может быть использован в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно для гена ESP [24].

Показано, что ESP увеличивает анибиотико-резистентность E. faecalis в мочевом пузыре при экспериментальных инфекциях мочевыводящих путей. Для исследования были взяты ESP положительный штамм E. faecalis и изогенный ESP-дефицитный мутантный штамм. В ходе исследования, группы мышей заражали трансуретрально в дозе 100000 CFU ESP содержащего и контрольного щтамма. Через 5 дней бактерии были подсчитаны в моче, мочевом пузыре и почках. У экспериментальных мышей, зараженных штаммом E. Faecalis, содержащим ESP, обнаружено достоверно большее число бактерий. Сделан вывод о том, что ESP способствует фиксации E. Faecalis к эпителию мочевого пузыря [28].

Агрегативная субстанция (AS) является феромон индуцируемым поверхностным белком E. Faecalis, который способствует образованию агрегатов спаривания во время конъюгации бактерий [29]. AS является медиатором эффективного энтерококкового контакта донор-реципиент для осуществления трансфера плазмиды. В естественных условиях, AS может участвовать в патогенезе энтерококковой инфекции посредством ряда механизмов [30]. К различным функциям, приписываемым AS, в дополнение к продвижению межклеточного контакта, является адгезия к клеткам-хозяевам, включая адгезию к белкам внеклеточного матрикса белков и увеличение гидрофобных свойств поверхности клетки. Было установлено, что энтерококки, обладающие AS, значительно более резистентны к фагоцитозу, чем изогенные AS-отрицательные штаммы, в связи с угнетающим воздействием на дыхательный обмен (производство активных форм кислорода) в макрофагах [31, 33].

«Асе» – это коллаген, связывающий MSCRAMM (Microbial surface component recognizing adhesive matrix molecule) что можно перевести, как микробные поверхностные компоненты, распознающие адгезивные молекулы матрикса. Этот фактор вирулентности присутствует как у сапрофитных, так и патогенных штаммах энтерококков [34, 35]. При энтерококковой инфекции у человека производятся антитела к Асе, которые блокируют адгезию протеинам экстрацеллюлярного матрикса in vitro [16, 36]. Этот компонент вирулентности выделен в 90 % наблюдений при эндокардите энтерококковой этиологии, что подтверждает его экспрессию in vivo. Аналог Асе, обозначенный как Асм, выделен в культуре E. Faecium [37].

Капсульные полисахариды и углеводы клеточной стенки бактерий. Оперон, кодирующий синтез капсулярного полисахарида наиболее часто обнаруживается у патогенных вариантов E. faecalis [38]. Была определена химическая формула второго вида капсулярного полисахарида, находящегося на поверхности как E. Faecalis, так и E. Faecium [39]. В экспериментальном исследовании, проведенном на инфицированных энтерококками мышах, были показаны защитные свойства антител, вырабатываемых против очищенной углеводной фракции клеточной стенки энтерококков. Высказано предположение о возможном использовании данных антител для профилактики энтерококковых инфекций [40]. Очищенная углеводная фраукция клеточной стенки состоит из глицерола фосфата, глюкозы и остатков галактозы [40].

Внеклеточный супероксид. Изолированные от кровотока E. faecalis обладают способностями производить супероксид [41]. Производство супероксида, наблюдаемое при смешанных инфекциях с Bacteroides fragilis подкожной локализации, целесообразно для повышения выживаемости микроорганизма [42].

Заключение

Энтерококки, которые считались безобидными сапрофитными микроорганизмами, проживающими в кишечнике, в последние десятилетия явились причинами тяжелых инфекционных процессов различной локализации, отличаясь широкой антибиотикорезистентностью и выраженной вирулентностью. Проведенные исследования выявили многочисленные островки патогенности (PAI) и генетические различия между сапрофитными и патогенными штаммами энтерококков, обладающих генами, кодирующими продукцию агрессивных протеинов различного вида (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8).

Необходимо проведение дальнейших исследований для выяснения механизмов целлюлярного и молекулярного взаимодействия энтерококков с клетками хозяина, ведущего к формированию высоко вирулентных форм энтерококков.