В настоящее время установлено, что вирулентность микроорганизма регулируется генами, кодирующими вирулентность, находящимися в особых регионах генома, которые именуются островками патогенности (pathogenicity islands, PAI) [9]. PAI энтерококка были впервые идентифицированы в геноме мультирезистентного к антибиотикам штамма E. faecalis [MMH594], который был причиной вспышки внутрибольничной инфекции в 1980-х годах [10]. Размер гена энтерококка составляет около 150 Кб и кодирует до 129 открытых рамок считывания (ORF).
Поразительная особенность была выявлена путем сравнения последовательностей, составляющих PAI в штамме MMH594 между V583 и V586 [11]. Была обнаружена способность модулировать вирулентность организма путем селективного удаление конкретных островков патогенности. Сравнение между подвидами ванкомицин-резистентных энтерококков также выявило высокую степень идентичности последовательностей PAI за исключением присутствия или отсутствия отдельных элементов. Способность к изменениям подобного рода позволяет энтерококку перемещаться в различные биотопы хозяина, вызывая развитие патологического процесса [12]. Однако такие способности – далеко не единственный фактор вирулентности энтерококков. Ряд исследований [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20] определили различные факторы вирулентности, наиболее важными из которых являются гемолизин, желатиназа, энтерококковый поверхностный белок (ESP), агрегативная субстанция (AS), Асе MSCRAMM, капсульные полисахариды и углеводы клеточной стенки бактерий, супероксид.
Гемолизин – цитолитический белок, способный лизировать эритроциты человека, лошади и кролика. Гемолизин продуцируют штаммы энтерококка, которые продемонстрировали высокую вирулентность в экспериментальных исследованиях у животных и в клинических условиях у человека [5, 21, 22], продукция гемолизина ассоциируется с повышением тяжести инфекционного процесса [23]. Гемолизин выявляется при посеве энтерококка на питательный агар на основе бульона из говяжьего сердца с добавлением 5 % крови лошади. Чашки Петри инкубируются в СО2 камере при температуре в 37 °С с контролем через 24 и 48 часов. Четкая зона гемолиза вокруг колоний микроорганизмов позволяет говорить о наличии гемолизина [24]. Экспрессия гемолизина или цитолизина определяется двухкомпонентной регулирующей системой через кворум-чувствительный механизм [19].
Желатиназа – протеаза, продуцируемая энтерококками, которая способна гидролизовать желатин, коллаген, казеин, гемоглобин и другие пептиды [25]. Было показано, что желатиназа, продуцируемая штаммами E. faecalis , отвечает за вирулентность микрпоорганизма при экспериментальном эндокардите у животных [26]. Способность продуцировать желатиназу в лабораторных условиях может быть выявлена при посеве энтерококков на среду из свежеприготовленного пептон-дрожжевого экстракт-агара, содержащего желатиновые пластинки. Чашки Петри инкубируют при 37 °С в течение ночи, затем охлаждают до комнатной температуры в течение двух часов. Наличие зон гало вокруг колоний свидетельствует о положительном результате [24, 27].
Энтерококковый поверхностный белок (Enterococcal surface protein [ESP] – это связанный с клеточной стенкой микроорганизма протеин, чаще обнаруживаемый у штаммов, перешедших в патогенную форму, чем у сапрофитных энтерококков (18). ПЦР амплификация гена ESP может быть выполнена при помощи праймеров ESP11 (5’-TTGCTAATGCTAGTCCACGACC-3’) и Esp 12 (5’-GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA-3’), которые соответствуют нуклеотидным позициям 1217-1238 и 2149-2171 соответственно, внутри N-терминала Esp (24). Микст для ПЦР реакции состоит из 250 нг DNA; по 0.2 µL dATP [2’-диоксиаденозин 5’-трифосфат], dCTP [2’-диоксицитозин 5’-трифосфат], dGTP [2’-диоксигуанозин 5’-трифосфат], and dTTP [2’-диокситимидин 5’-трифосфат]; 2.5 mM MgCl2; и 2.5 U AmpliTaq DNA полимеразы в 1 x реакционном буфере (24).
Образцы проходят инициальную денатурацию при 95 °С в течение двух минут и подвергаются 30 циклам денатурации [94 °С в течение 45 с], отжига [63 °С в течение 45 секунд] и расширения [72°C в течение одного мин]. Пять микролитров амплификационной смеси должны быть смешаны с загрузочным буфером гель и подвергали электрофорезу в один процент агарозном геле. Продукты реакции могут быть визуализированы с помощью окрашивания бромидом этидия. ДНК из культуры E. faecalis MMH594 и FA2-2 может быть использован в качестве положительного и отрицательного контролей соответственно для гена ESP [24].
Показано, что ESP увеличивает анибиотико-резистентность E. faecalis в мочевом пузыре при экспериментальных инфекциях мочевыводящих путей. Для исследования были взяты ESP положительный штамм E. faecalis и изогенный ESP-дефицитный мутантный штамм. В ходе исследования, группы мышей заражали трансуретрально в дозе 100000 CFU ESP содержащего и контрольного щтамма. Через 5 дней бактерии были подсчитаны в моче, мочевом пузыре и почках. У экспериментальных мышей, зараженных штаммом E. Faecalis, содержащим ESP, обнаружено достоверно большее число бактерий. Сделан вывод о том, что ESP способствует фиксации E. Faecalis к эпителию мочевого пузыря [28].
Агрегативная субстанция (AS) является феромон индуцируемым поверхностным белком E. Faecalis, который способствует образованию агрегатов спаривания во время конъюгации бактерий [29]. AS является медиатором эффективного энтерококкового контакта донор-реципиент для осуществления трансфера плазмиды. В естественных условиях, AS может участвовать в патогенезе энтерококковой инфекции посредством ряда механизмов [30]. К различным функциям, приписываемым AS, в дополнение к продвижению межклеточного контакта, является адгезия к клеткам-хозяевам, включая адгезию к белкам внеклеточного матрикса белков и увеличение гидрофобных свойств поверхности клетки. Было установлено, что энтерококки, обладающие AS, значительно более резистентны к фагоцитозу, чем изогенные AS-отрицательные штаммы, в связи с угнетающим воздействием на дыхательный обмен (производство активных форм кислорода) в макрофагах [31, 33].
«Асе» – это коллаген, связывающий MSCRAMM (Microbial surface component recognizing adhesive matrix molecule) что можно перевести, как микробные поверхностные компоненты, распознающие адгезивные молекулы матрикса. Этот фактор вирулентности присутствует как у сапрофитных, так и патогенных штаммах энтерококков [34, 35]. При энтерококковой инфекции у человека производятся антитела к Асе, которые блокируют адгезию протеинам экстрацеллюлярного матрикса in vitro [16, 36]. Этот компонент вирулентности выделен в 90 % наблюдений при эндокардите энтерококковой этиологии, что подтверждает его экспрессию in vivo. Аналог Асе, обозначенный как Асм, выделен в культуре E. Faecium [37].
Капсульные полисахариды и углеводы клеточной стенки бактерий. Оперон, кодирующий синтез капсулярного полисахарида наиболее часто обнаруживается у патогенных вариантов E. faecalis [38]. Была определена химическая формула второго вида капсулярного полисахарида, находящегося на поверхности как E. Faecalis, так и E. Faecium [39]. В экспериментальном исследовании, проведенном на инфицированных энтерококками мышах, были показаны защитные свойства антител, вырабатываемых против очищенной углеводной фракции клеточной стенки энтерококков. Высказано предположение о возможном использовании данных антител для профилактики энтерококковых инфекций [40]. Очищенная углеводная фраукция клеточной стенки состоит из глицерола фосфата, глюкозы и остатков галактозы [40].
Внеклеточный супероксид. Изолированные от кровотока E. faecalis обладают способностями производить супероксид [41]. Производство супероксида, наблюдаемое при смешанных инфекциях с Bacteroides fragilis подкожной локализации, целесообразно для повышения выживаемости микроорганизма [42].
Заключение
Энтерококки, которые считались безобидными сапрофитными микроорганизмами, проживающими в кишечнике, в последние десятилетия явились причинами тяжелых инфекционных процессов различной локализации, отличаясь широкой антибиотикорезистентностью и выраженной вирулентностью. Проведенные исследования выявили многочисленные островки патогенности (PAI) и генетические различия между сапрофитными и патогенными штаммами энтерококков, обладающих генами, кодирующими продукцию агрессивных протеинов различного вида (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8).
Необходимо проведение дальнейших исследований для выяснения механизмов целлюлярного и молекулярного взаимодействия энтерококков с клетками хозяина, ведущего к формированию высоко вирулентных форм энтерококков.