Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Костномозговые предшественники (КМП), включающие гемопоэтические предшественники (ГП) и эндотелиальные прогениторные клетки (ЭП), играют важную роль в эндотелиальном гомеостазе и неоваскуляризации. Мобилизация КМП при стресс-индуцирующих и повреждающих воздействиях обеспечивается выбросом провоспалительных цитокинов и рассматривается в качестве одного из механизмов репаративного ответа. Кроме того, индукторами мобилизации КМП могут выступать половые гормоны – прогестерон и эстроген, которые не только рекрутируют КМП в циркуляцию, но и предохраняют их от старения и гибели [9]. Однако, значение феномена мобилизации КМП при беременности остается во многом неясным. Хорошо известно, что процессы ангиогенеза и васкулогенеза во время беременности играют ведущую роль в обеспечении фето-плацентарной васкуляризации, обеспечивающей нормальное развитие плаценты. Учитывая способность КМП продуцировать проангиогенные факторы, можно полагать, что циркулирующие КМП могут опосредовать и активировать процессы васкулогенеза и ангиогенеза. С другой стороны в последние годы появились данные об иммуномодулирующих свойствах КМП, которые связывают с продукцией иммуносупрессорных цитокинов/медиаторов (IL-6, SDF-1, VEGF), способностью индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов и стимулировать генерацию регуляторных Т-клеток [1]. В этом аспекте циркулирующие КМП могут способствовать формированию иммунологической толерантности, обеспечивающей физиологическое течение беременности. Соответственно, снижение эффективности мобилизации КМП может быть сопряжено с развитием патологии беременности вследствие нарушения процессов плацентации и формирования иммунологической толерантности.

Данные литературы о содержании циркулирующих КМП при физиологической и осложненной беременности немногочисленны и неоднозначны. Что касается содержания CD45⁺CD34⁺ клеток при беременности, то в работе Vacca с соавторами показано их наличие в децидуальной ткани и возможность дифференцировки в натуральные киллерные клетки [10]. В исследованиях, касающихся динамики ЭП при беременности, показано нарастание числа CD45^dimCD34⁺KDR⁺ клеток в течение гестационного процесса [5] и снижение этих клеток у женщин с преэклампсией (ПЭ) [3, 5]. Противоположные результаты были получены Matsubara с соавторами, которые не нашли различий в содержании CD34⁺CD133⁺VEGFR2⁺ клеток у небеременных и беременных в первом триместре гестации, выявили снижение доли ЭП в динамике физиологической беременности и не обнаружили различий в количестве этих клеток у женщин с ПЭ и здоровых беременных [6].

Развитие гестационных осложнений сопряжено как с эндотелиальной дисфункцией, так и с воспалительным процессом, который сопровождается повышением продукции провоспалительных цитокинов и медиаторов. Одним из чувствительных биомаркеров системной воспалительной реакции является С-реактивный белок (СРБ), уровень которого существенно повышен у беременных с ПЭ [8]. Системная воспалительная реакции вызывают мобилизацию КМП, однако в высоких концентрациях провоспалиетльные цитокины способны оказывать токсическое действие на прогениторные клетки. Поэтому развитие системной воспалительной реакции может негативно влиять на количество КПМ.

Учитывая вышеизложенное, в настоящей работе планировалось охарактеризовать количественное содержание гемопоэтических предшественников при физиологической беременности, а также у женщин с осложненной гестацией и исследовать взаимосвязь между количеством циркулирующих ГП и уровнем С- реактивного белка.

Материалы и методы исследования

Работа основана на результатах иммунологического и клинико-лабораторного обследования беременных, которое включало ультразвуковое исследование плода, доплерографию, кардиотокографию, клинико-лабораторные, биохимические и иммунологические исследования. Степень тяжести гестационных осложнений оценивалась по совокупности клинических и лабораторных показателей, данных УЗИ, КТГ и доплерометрии. В исследование были включены 60 беременных и 16 небеременных женщин репродуктивного возраста. В I триместре было обследовано 40 беременных, из них у 29 женщин (группа 1) беременность протекала без осложнений, у 11 женщин (группа 2) была диагностирована угроза самопроизвольного выкидыша (УСВ). Сформированные группы были сопоставимы по возрасту (27,6 ± 0,8 vs 28,3 ± 0,9 лет; соответственно) и срокам гестации (9,5 ± 0,5 vs 8,4 ± 0,8; соответственно). Шестнадцать женщин с физиологической беременностью (из группы 1) были обследованы повторно в III триместре. Отдельную группу составили 20 беременных в III триместре, имеющих поздние гестационные осложнения, включая 13 – с тяжелыми формами гестоза и 7 – с преэклампсией. Беременные с физиологической и осложненной беременностью в III триместре были сопоставимы по возрасту (28,5 ± 1,0 vs 30,2 ± 1,1 лет; соответственно) и срокам гестации (31,0 ± 1,0 vs 29,5 ± 1,1; соответственно). На момент исследования у всех беременных отсутствовали хронические заболевания в стадии обострения, острые инфекционные заболевания, эндокринная патология, тяжелая экстрагенитальная патология. Контрольная группа небеременных включала 16 фертильных женщин без отягощенного акушерско-гинекологического анамнеза, с регулярным менструальным циклом. Средний возраст женщин составил 29,6 ± 2,9.

Иммунологическое обследование осуществляли с информированного согласия женщин. Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови выделяли центрифугированием цельной, гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколл-гипак (р = 1,078). Количественное содержание гемопоэтических (CD34⁺CD45⁺) предшественников оценивали методом проточной цитометрии (Becton Dickinson, США) с использованием анти-CD45 мАТ, меченных FITC (BD PharMingen, San Diego,CA, США), анти-CD34 мАТ, меченных PE с применением программы Cell Quest (рисунок). Абсолютное содержание CD34⁺CD45⁺ клеток рассчитывали по формуле – лейкоциты х106/LхCD34⁺CD45⁺( %). Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием программы «STATISTICA 6.0». Сравнение вариационных рядов осуществлялось с помощью непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции Спирмена.

Результаты исследования и их обсуждение

Оценка CD34⁺45⁺ клеток в периферической крови небеременных фертильных женщин показала, что абсолютное количество ГП варьировало от 0,69 до 3,89х10⁹/L клеток. У женщин с физиологической беременностью в I триместре гестации достоверных различий с группой небеременных не регистрировалось (табл. 1). Однако, индивидуальный анализ показал, что в 44 % случаев (13/29) содержание ГП превышало верхнюю границу интерквартильного диапазона (у небеременных женщин). У беременных c УСВ содержание CD34⁺CD45⁺ клеток также значимо не отличалоcь от такового у небеременных. Индивидуальный анализ выявил превышение верхней границы нормативного диапазона в 36 % случаев (4/11). Концентрация СРБ как у женщин с физиологической беременностью, так и у беременных с УСВ находилась в пределах нормативного диапазона. При этом уровень СРБ не зависел от содержания ГП.

CD45⁺CD34⁺ клетки были выделены путем последовательного гейтирования

Таблица 1

Содержание циркулирующих предшественников костномозговых клеток у женщин в 1 триместре гестации и небеременных женщин

Примечание. Данные представлены в виде медианы и значений интерквартильного диапазона.

Таблица 2

Содержание циркулирующих предшественников костномозговых клеток у беременных в I и III триместрах гестации

Примечание. Данные представлены в виде медианы и значений интерквартильного диапазона; * p < 0,05 –достоверность различий между группами беременных.

Таблица 3

Содержание циркулирующих предшественников костномозговых клеток у женщин с физиологической и осложненной беременностью

Примечание. * p < 0,05; **p < 0,01 – достоверность различий между группами с физиологической беременностью и с осложненной беременностью (гестозом и ПЭ).

Таблица 4

Содержание циркулирующих предшественников костномозговых клеток в группах женщин с гестозом с наличием и отсутствием СЗРП

Примечание. Данные представлены в виде медианы и значений интерквартильного диапазона.

Сравнение количества циркулирующих ГП в группе 16 женщин с физиологическим течением беременности в I и III триместре выявило значимое возрастание абсолютного содержания CD34⁺CD45⁺ клеток по мере увеличения гестационного срока (табл. 2). Так количество ГП в III триместре было почти в 3 раза выше, чем в I триместре. При этом частота беременных с повышенным уровнем CD34⁺CD45⁺ клеток составляла 75 % (12/16). Возрастание доли ГП регистрировалось на фоне увеличения абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов. Также регистрировалась тенденция к возрастанию относительного содержания CD34⁺45⁺ клеток. В то же время, несмотря на возрастание ГП в III триместре беременности, уровень СРБ в эти сроки не отличался от такового в I триместре.

Далее было проведено сравнительное исследование показателей мобилизации ГП в группах женщин в III триместре физиологической и осложненной беременности (табл. 3). Беременные с гестозом отличались от женщин с физиологической беременностью достоверно более низким содержанием CD34⁺CD45⁺ клеток. Если у женщин с неосложненной гестацией возрастание ГП наблюдалось в 75 % случаев (12/16), то у беременных с гестозом – только в 7 % случаев (1/13). Более того, содержание ГП при гестозе было сравнимо с показателями у небеременных женщин. Характерно, что низкое содержание ГП у беременных с гестозом регистрировалось на фоне повышенного уровня СРБ. Более того, анализ корреляционной зависимости между концентрацией СРБ в сыворотке крови и количеством ГП у женщин в III триместре беременности выявил достоверную обратную взаимосвязь между указанными параметрами (r_sp = – 0,46; p > 0,05).

В группе беременных с ПЭ снижение содержания CD34⁺CD45⁺ клеток было менее выраженным и проявлялось в виде тенденции, что было обусловлено значительной вариабельностью количества ГП (0,9х10⁶/L – 8,2х10⁶/L). Возрастание ГП наблюдалось у 3 из 7 беременных (42 %), тогда как у 4 беременных количество CD34⁺CD45⁺ клеток оставалось в пределах нормативного диапазона. Уровень СРБ у беременных с ПЭ в 7 раз превышал аналогичный показатель у женщин с физиологической беременностью, однако не коррелировал с количеством ГП.

Следует отметить, что у 3 из 13 беременных с тяжелым гестозом и у всех беременных с ПЭ регистрировался СЗРП. Сравнительное исследование между беременными с наличием и отсутствием СЗРП выявило тенденцию к более низкому содержанию CD34⁺45⁺ клеток и повышению СРБ у женщин с наличием СЗРП (табл. 4).

В обзоре литературы представлены немногочисленные данные об изменении КМП в динамике гестационного процесса, при этом в большинстве случаев исследования касаются популяции ЭП. Результаты, полученные авторами, достаточно противоречивы, так как в одних работах отмечается повышение числа ЭП [5], в других – снижение ЭП в III триместре гестации [6]. Изменения в содержании другой популяции КМП, гемопоэтических прекурсоров, показаны при сердечно-сосудистой патологии и воспалительных процессах. В нашей работе мы проанализировали содержание CD34⁺CD45⁺ клеток у беременных в I и III триместрах гестации. Полученные данные выявили тенденцию к повышению содержания CD34⁺CD45⁺ клеток у женщин при наступлении беременности (по сравнению с группой небеременных). При этом сходные тенденции к увеличению доли ГП регистрируются как при физиологической беременности, так и у женщин с УСВ. Характерно, что в динамике физиологической беременности доля CD34⁺CD45⁺ клеток нарастает и в III триместре уже значимо отличается от содержания КМП у небеременных и беременных в I триместре. Мобилизация КМП в циркуляцию при беременности может быть обусловлена повышением продукции эстрогенов при беременности и формированием фето-плацентарного комплекса (ФПК). Так, в экспериментальной работе Illing с соавторами показано наличие рецепторов к эстрогенам на ГП и непосредственное влияние на них эстрадиола [4].

Наиболее частым осложнением второй половины беременности является фето-плацентарная недостаточность (ФПН), развитие которой ассоциировано с эндотелиальной дисфункцией, что в свою очередь приводит к развитию у беременных гестоза и ПЭ. В литературе имеются данные о более низком содержании ЭП у беременных с ПЭ [3], либо отсутствии различий в их содержании [5, 6]. В своей работе мы провели сравнительное исследование содержания ГП у женщин в III триместре физиологической и осложненной беременности. Согласно полученным данным у женщин с гестозом выявлено достоверно более низкое число CD34⁺CD45⁺ клеток по сравнению с беременными, не имеющими осложнений. В группе беременных с ПЭ выявлена тенденция к снижению доли циркулирующих ГП. При исследовании влияния СЗРП на мобилизацию ГП было выявлено снижение их количества в 1,7 раза у беременных с СЗРП, но различия проявлялись в виде тенденции. Сходные данные о снижении ЭП у беременных с СЗРП были получены Monga с соавторами [7].

Роль ГП при беременности не ограничивается их участием в нео- и васкулогенезе, в работе Vacca с соавторами показано наличие в децидуальной ткани CD34⁺CD45⁺ клеток, которые способны дифференцироваться в киллерные клетки [10].

Снижение содержания ГП при развитии гестационных осложнений может быть обусловлено системным воспалительным ответом, который сопровождается усилением продукции провоспалительных цитокинов и биологически активных факторов (СРБ). Согласно данным литературы повышенный уровень СРБ регистрируется у женщин с гестационными осложнениями [2]. Также известно, что СРБ обладает способностью повреждать сосудистую стенку, снижать выживаемость, дифференцировку и активность КМП [8]. В нашем исследовании у женщин в III триместре регистрировалось повышение числа ГП, но уровень СРБ не изменялся. У беременных с гестозом и ПЭ доля ЭП снижалась, а уровень СРБ повышался. Из данных литературы известно о супрессорной активности КМП [1], поэтому снижение доли ГП может быть одной из причин повышения СРБ. Возможно, что нарушение физиологической иммуносупрессии при беременности и, как следствие, срыв толерантности, приводит к развитию системного воспалительного ответа. С другой стороны высокий уровень СРБ может приводить к усилению апоптоза ГП. Полученные данные не позволяют однозначно интерпретировать результаты, необходимы дальнейшие исследования.

Представленные результаты об изменении содержания ГП в динамике беременности и при развитии осложнений свидетельствуют об их участии в гестационном процессе. Мобилизация ГП наиболее выражена в III триместре гестации, только у женщин с физиологическим течением беременности и отсутствует при развитии гестационных осложнений. Снижение содержания ГП может служить косвенным биомаркером развития гестоза и ПЭ.