Апоптоз как вид запрограммированной клеточной смерти наряду с некрозом является одним из ключевых вариантов ответа клетки на повреждение. Апоптоз играет большую роль в патогенезе многих заболеваний. В связи со сказанным ранее актуальной является разработка простой методики in vivo для изучения и скрининговой оценки влияния терапевтических воздействий на выраженность некроза и апоптоза.
Цель работы – разработка скринингового метода оценки протекторных свойств терапевтических воздействий на модели ультрафиолетового повреждения кожи у крыс.
Материалы и методы исследования
Исследование выполнено в лаборатории кафедры общей и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО КубГМУ. Эксперименты проведены на 6 белых нелинейных самцах крыс средней массой – 250 ± 35 гр. Содержание животных и постановка экспериментов проводилась в соответствии с требованиями приказов № 1179 МЗ СССР от 11.10.1983 года и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 года, а также международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Все оперативные вмешательства сопровождались использованием золетил-ксилазинового наркоза по следующей схеме: золетил 0,3 мг в/м («Virbac» Франция), ксиланит 0,8 мг в/м (ЗАО «НИТА-ФАРМ, Россия, г. Саратов), атропина сульфат 0,1 % раствор – 0,01 мл п/к из расчета на 100 гр. массы тела животного. Наркоз верифицировали по исчезновению реакции на болевые раздражители (укол лапы) и угнетению роговичного рефлекса.
Крысы были разделены на 2 группы: группа № 1 – из 2 животных, интактные крысы; группа № 2 – из 4 крыс, которым проведен сеанс ультрафиолетового облучения кожи.
Облучение кожи проводилось с использованием ультрафиолетового облучателя ОББ-92У с лампой мощностью 30 ватт, длиной волны 253,7 нм.
После введения наркоза на боку крысы в участке размером 4х4 см проводилось удаление шерсти. Далее на эту область проводилось наложение плотной ткани с вырезанным участком размером 3х3 см. Ультрафиолетовый облучатель располагался на высоте 20 см от уровня кожи. Проводился один сеанс облучения в течение 25 минут, после чего крысу оставляли в клетке на сутки.
На следующие сутки после облучения под наркозом проводился забор участка облученной кожи, с последующей его фиксацией в 10 % растворе забуференного фосфатами нейтрального формалина, на 2-е суток. Для изготовления гистологических препаратов из кожи крыс была проведена модификация методики проводки в парафин с использованием изопропанола и минерального масла (изменялось время экспозиции в растворах, принципиальная схема не менялась). В дальнейшем изготавливались парафиновые блоки, проводилась их нарезка на микротоме МПС-2 (СССР) на срезы с толщиной 10 мкм. Проводилось монтирование срезов на покрытые адгезивным покрытием предметные стекла. Микропрепараты окрашивались гематоксилином-эозином, а также по методу Браше. Полученные микропрепараты фотографировали с помощью окулярной камеры «Levenhuk 230» (США) на микроскопе Микромед-6 (Россия).
Результаты исследования и их обсуждение
Случаев незапланированной гибели и осложнений у животных зарегистрировано не было. При исследовании микропрепаратов полученных от крыс из группы № 1 – интактные животные, выявлено нормальное строение кожи крысы. При исследовании микропрепаратов полученных от крыс из группы № 2 – подвергшихся облучению оголенной кожи крысы в течение 20 минут с использованием УФ-лампы мощностью 30 ватт, длиной волны 253,7 нм нами обнаружена микроскопическая картина УФ-индуцированного дерматита. При исследовании микропрепаратов окрашенных гематоксилином-эозином отмечается наличие признаков отека и стаза крови в сосудах дермы. Незначительно выраженная нейтрофильная инфильтрация дермы. Наличие участков отслойки рогового слоя эпителия от дермы. Признаки неоднородной окраски ядер кератиноцитов, появление «солнечно-ожоговых клеток» (кератиноцитов в состоянии апоптоза). При окраске микропрепаратов по методу Браше наряду с клетками имеющие в своем составе ДНК и РНК, обнаруживается большое число предположительно кератиноцитов окрашенных только метиловым зеленым, наличия окраски пиронином, который окрашивает РНК в них не выявлено, что косвенно свидетельствует о функциональной неактивности ядер, остановившихся процессах транскрипции и трансляции. Расположение неактивных клеток соответствует таковому расположению «солнечно-ожоговых клеток» на срезах.
Выводы
Облучение оголенной кожи крысы в течение 20 минут с использованием УФ-лампы мощностью 30 ватт, длиной волны 253,7 нм приводит к развитию ультрафиолетового дерматита, при этом наряду с некротизированными обнаруживаются кератиноциты в состоянии апоптоза «солнечно-ожоговые клетки». Мы разработали модель ультрафиолетового облучения кожи, которая потенциально может применяться в качестве скринингового метода оценки протекторных свойств лечебных воздействий.