Проблема оптимизации хирургического лечения переломов и ложных суставов костей конечностей является основной проблемой современной травматологии и ортопедии. Достижение сращения перелома, восстановления функции повреждённой конечности в максимально короткие сроки позволяет вернуть пациентов к активной трудовой деятельности, повысить качество их жизни. Однако, несмотря на постоянное совершенствование конструкций для остеосинтеза результаты лечения пациентов продолжают неудовлетворять хирургов. В связи с этим перспективы улучшения результатов лечения переломов и их последствий многим исследователям видится в воздействии на процесс репаративной регенерации. Большое разнообразие методик стимуляции репаративного процесса, свидетельствует о существенных различиях в принципах решения этой проблемы [6, 4, 3]. В последние годы в связи с бурным развитием клеточных и нанотехнологий активно исследуются методы воздействия на звенья репаративной костной регенерации с использованием стволовых мезенхимальных клеток и аутологичного костного мозга. Однако эти перспективные методы воздействия на остеогенез в настоящее время либо находятся в стадии изучения, либо малодоступны из-за технической сложности [5, 8, 9].
Механическая травма (ушибы, ранения тканей и т.д.) с современных позиций рассматривается как неинфекционный флогогенный фактор развития воспаления. Воспаление же направлено на восстановление повреждённых тканей и как любой типовой патологический процесс в основных своих чертах протекает стандартно, независимо от вызвавших его причин, где бы оно ни локализовалось [2]. В связи с этим оценка иммунологического статуса и его изменения под влиянием травмирующего агента, оперативного вмешательства и применяемых методов стимуляции регенерации позволит судить об эффективности методов стимуляции в процессе заживления костной раны.
Цель исследования. Оценка динамики изменений цитокинового профиля при использовании различных методов стимуляции репаративной регенерации костной ткани в эксперименте.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования явились 24 экспериментальных животных (кролика), в возрасте 6-7 месяцев, с массой тела 3,3-4,5 кг. Нами выбрана хорошо зарекомендовавшая себя модель с использованием чрескостного остеосинтеза аппаратом внешней фиксации на голени животного. Были изготовлены облегченные модели аппарата Илизарова. Эксперименты на животных проводились в соответствии с приказом Минздрава СССР от 12.08.1977г. №755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» (по состоянию на 20.10.2006г.), а также Федеральным законом «О защите животных от жестокого обращения» от 01.12.1999г.
Техника оперативных вмешательств заключалась в следующем: в месте синостозирования малоберцовой и большеберцовой костей (в средней трети голени) производили поперечный перелом кости, выполняли его остеосинтез облегченной моделью аппарата Илизарова, включающей четыре кольца из сплавов алюминия (вес в собранном виде составляет 190 г, то есть 5 % от массы тела животного).
Затем производили один из трех видов стимулирующего воздействия на репаративный процесс, в зависимости от которых были определены группы эксперимента.
В 1-ю группу выделили животных, которым производили стимуляцию только путём туннелизации проксимального и дистального отломков в двух плоскостях на расстоянии 5 мм от перелома. Во 2-й группе выполняли гидродинамическое воздействие на костномозговое содержимое путём вытеснения последнего под давлением жидкостью (3 мл) через иглу, введённую в проксимальный метадиафиз большеберцовой кости. В 3-й экспериментальной группе выполняли комбинированное воздействие (туннелизацию проксимального и дистального отломков и гидродинамическое воздействие на костномозговое содержимое). В 4-й группе (контрольной) дополнительных воздействий на зону перелома не осуществляли.
После операции выполняли контрольную рентгенографию голени, после чего кролика помещали в клетку. Животным позволялась полная нагрузка на конечности и движение без ограничений после операции.
Для оценки динамики изменений показателей цитокинового профиля при использовании различных методов стимуляции регенерации нами проведены исследования сыворотки крови кроликов до операции и через 1, 2, 3 недели после оперативного вмешательства.
Сыворотку крови кроликов получали путем пункции краевой вены уха и определяли показатели цитокинового профиля (интерлейкин-1, интерлейкин-6, интерлейкин-8, фактор некроза опухоли) методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием микропланшетного ридера Anthos 2020 (сертификат соответствия № РОСС RU.0001. 11ИМ02 от 13.01.2010). Для определения показателей использовали следующие тест-системы:
Интерлейкин-1 ß -cE 90563Rb 96 Test Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit for Interleukin 1 Beta (IL-1 b). Organism: Oryctolagus cuniculus (Rabbit), сертифицирован – ISO9001:2008, ISO13485:2003; USA (Uscn).
Интерлейкин-6 sE 90079-96 (IL-6). Test Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit for Interleukin-6. Organism: Oryctolagus cuniculus (Rabbit) – сертифицирован – ISO9001:2008, ISO13485:2003; USA (Uscn).
Интерлейкин-8 sE 90080Rb (IL-8). Organism: Oryctolagus cuniculus (Rabbit) – сертифицирован – ISO9001:2008, ISO13485:2003; USA (Uscn).
Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) sE901133 96 – Test Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit for Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α). Organism: Oryctolagus cuniculus (Rabbit) – сертифицирован – ISO9001:2008, ISO13485:2003; USA (Uscn).
Результаты исследования и их обсуждение
При оценке содержания интерлейкина-1 (IL-1) в сыворотке крови выявлены следующие закономерности: во 2-й и 3-й экспериментальных группах через 1 неделю после операции отмечается резкий подъём (в 2 раза по сравнению с дооперационными значениями) уровня IL-1 в сывортке крови с последующим его снижением на 2 недели после операции. Во 2-й группе этот показатель возвращается к нормальному уровню через 3 недели, а в 3-й группе уровень IL-1 через 3 недели продолжает сохраняться на высоких цифрах от исходных значений. В 1-й экспериментальной группе содержание IL-1 планомерно нарастает в течение всего послеоперационного периода и достигает максимума через 3 недели, превышая при этом исходный уровень на 30 %. В контрольной же (четвёртой) группе этот показатель снижен на протяжении всего послеоперационного периода (на 10-20 %).
Уровень интерлейкина-6 (IL-6) в сыворотке крови у животных 1 и 2 групп планомерно нарастал, достигая максимума на 2-й неделе послеоперационного периода (в среднем на 30 % от дооперационного уровня), с последующим незначительным понижением ниже исходного уровня на 3-й неделе. В 4-й группе имелась аналогичная картина, но с пиком уровня IL-6 на 2-й неделе после операции. В 3-й группе на протяжении 2 недель после операции отмечается снижение уровня IL-6 с последующим значительным (55 %) его повышением выше исходного уровня.
Во 2-й и 4-й (контрольной) группе на 1-й недели после операции наблюдалось небольшое снижение уровня интерлейкина-8 (IL-8) с его последующим повышением (10 %) на 2-й недели, а затем значительным снижение (30-50 %) ниже исходного уровня. В 1-й группе отмечалось повышение уровня IL-8 в сыворотке крови на 15-20 % с последующим его возвращением к исходному уровню на 3-й недели после операции. В 3-й экспериментальной группе наблюдается тенденция к снижению уровня IL-8, который достигает минимальных значений на 3-й недели послеоперационного периода.
Рис. 1. Динамика содержания IL-1 в сыворотке крови на разных сроках лечения
Рис. 2. Динамика содержания IL-6 в сыворотке крови на разных сроках лечения
Рис. 3. Динамика содержания IL-8 в сыворотке крови на разных сроках лечения
Рис. 4. Динамика содержания TNF-α в сыворотке крови на разных сроках лечения
При оценке содержания фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) в сыворотке крови в 1-й и 4-й группах животных обращает на себя внимание его плавное повышение на 10-20 % через 1 неделю после операции и последующее возвращение к исходному уровню уже ко 2 недели в 1-й группе и к 3-й недели в 4-й группе эксперимента. Во 2-й и 3-й группах этот показатель наоборот уже через 1 неделю после операции снижался ниже исходного уровня, сохраняясь на нём до 2-й недели, после чего у животных 2-й группы он возвращался к исходным значениям, а у животных 3-й группы продолжал оставаться пониженным.
Остро возникшее в ответ на альтерацию воспаление в большинстве своём заканчивается заживлением костной раны и длительность воспалительного процесса не превышает 4-6 недель, хотя в большинстве случаев он заканчивается через 2 недели. Общепринятыми медиаторами острого воспаления являются интерлейкин-1 и фактора некроза опухоли альфа. Медиаторами подострого и хронического воспаления служат интерлейкин-4 и интерлейкин-6. Выявленное нами повышение уровня IL-6 на сроке 3 недели в третьей экспериментальной группе свидетельствует, по всей видимости, о затяжном течении или хронизации процесса, замедленном костеобразовании.
Оценивая вышеизложенную динамику изменений показателей цитокинового профиля у лабораторных животных в четырёх группах эксперимента, можно констатировать, что наилучшие результаты их нормализации отмечены в группе, где в качестве стимуляционного воздействия использовался метод туннелизации проксимального и дистального фрагментов перелома. Это подтверждается и морфологическими исследованиями [7]. Большинство показателей (за исключением IL-1) в этой группе возвращалось к исходному уровню через 3 недели, а содержание TNF-α уже через 2 недели после оперативного вмешательства. Иммунологические показатели в четвёртой (контрольной) группе возвращались к нормальным значениям не раньше 3-й недели послеоперационного периода.
Туннелизация кости при компрометированном хондро- и остеогенезе, широко распространенная в ортопедии, получает подтверждение в нашем экспериментальном исследовании. Малотравматичный способ сверления спицевых отверстий следует рассматривать как дополнительный очаг ангио- и остеогенеза [1].