Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Хронический вирусный гепатит В вследствие своей широкой распространенности, тяжести течения заболевания и его последствий остается одной из наиболее актуальных проблем инфекционной патологии и гепатологии, как во всем мире, так и в Российской Федерации [10]. Особенно остро стоит этот вопрос в педиатрической практике, так как является одним из факторов детской инвалидизации [9]. Исследования, проведенные до настоящего времени, позволили установить многие элементы патогенеза этого заболевания, но вопросов, связанных с объяснением механизмов его течения, остается достаточно много.

Морфологические и гистологические методы анализа состояния ткани печени используются при диагностике и дифференциальной диагностике гепатитов вирусной и другой этиологии, причем достаточно часто они являются решающими в данной области. В то же время, дальнейшее их применение, в том числе с использованием морфометрического подхода, несомненно, будет способствовать получению более детальной и точной информации, раскрывающей новые механизмы развития хронического вирусного гепатита В.

Процессы повреждения и регенерации ткани печени при вирусных гепатитах протекают одновременно и во многом зависят от интенсивности и направленности реакций внутриклеточного метаболизма, характеристику которых можно получить при определении показателей активности ферментов [3]. В частности, наиболее информативными являются дегидрогеназы, участвующие в основных метаболических путях клеток и формирующие их функциональные возможности [4]. Однако изменения внутриклеточного метаболизма печеночной ткани при гепатитах остаются не изученными, так как немногочисленные исследования, проведенные при этих заболеваниях, посвящены, в основном, определению у больных активности ферментов в лимфоцитах крови [8], или же в печени животных при ее токсических поражениях в эксперименте [2].

Цель исследования: определение зависимости показателей активности внутриклеточных ферментов ткани печени и кариометрических параметров гепатоцитов, отражающих процессы повреждения и регенерации печени у детей, больных хроническим вирусным гепатитом В, от стадии хронизации этого заболевания.

Материалы и методы исследования

Обследовано 30 детей в возрасте от 12-и до 16-и лет, больных хроническим вирусным гепатитом В, диагноз которого устанавливался в условиях специализированного стационара с помощью стандартных клинико-биохимических, иммуноферментных методов анализа и подтверждался морфологически после проведения под контролем УЗИ пункционной биопсии печени с учетом гистологического индекса степени активности (ГИСА) и гистологического индекса стадии хронизации (ГИСХ) по В.В. Серову [7]. Морфометрическое исследование проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [1] .

Материал, полученный при биопсиях, использовался как для проведения морфологического и морфометрического исследования, так и для определения в ткани печени активности внутриклеточных ферментов биолюминесцентным методом [6]. Часть ткани печени (3-5 мг), получаемой при биопсии, гомогенизировали и в гомогенате определяли активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), НАД- и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ), НАД- и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и НАДФГДГ), НАД- и НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы (НАДМДГ и НАДФМДГ), а также глутатионредуктазы (ГР). Показатели активности ферментов выражали в микроединицах на 1 микрограмм ткани печени (мкЕ/мкг).

Полученные данные обработаны методами статистического анализа, используемыми в биологии и медицине, с применением пакета прикладных программ Statistica 6,0 и соответствующих рекомендаций [5]. В таблицах представлены: среднегрупповые показатели (М), ошибки средних (m), достоверность непараметрического критерия Манна-Уитни (U) для различий между показателями групп (р); значения и достоверность коэффициентов ранговой корреляции Спирмена между морфометрическими и энзиматическими показателями.

Результаты исследования и их обсуждение

Нами проведен анализ ряда кариометрических показателей гепатоцитов, а также показателей активности метаболических ферментов в ткани печени (табл. 1).

Таблица 1

Кариометрические и энзиматические показатели ткани печени детей при разных стадиях хронизации хронического вирусного гепатита В

Морфометрические показатели свидетельствовали о том, что при 3-й стадии хронизации гепатита В для гепатоцитов характерен больший, чем при 2-й стадии, объем ядра (соответственно 497,73±4,53 и 483,94±3,51; p<0,023). В то же время, при более тяжелой стадии заболевания определялись менее высокими число ядрышек (1,53±0,01 и 1,58±0,02; p<0,048) и объем ядрышкового материала (10,04±0,08 и 10,36±0,10; p<0,025). В связи с этим, и ядерно-ядрышковое соотношение в гепатоцитах при 3-й стадии хронизации гепатита было ниже, чем при 2-й стадии (49,59±0,32 и 46,79±0,24; p<0,001).

Несколько из определявшихся показателей характеризовали уровень повреждения гепатоцитов и регенераторную активность ткани печени при разной степени ее поражения патологическим процессом. Так, число ядер гепатоцитов, находящихся в интерфазном состоянии, при 3-й стадии было выше, чем при 2-й (52,00±0,49 и 33,06±0,41; p<0,001), а показатель числа ядер, находящихся в состоянии деления, наоборот, был ниже (66,94±0,41 и 47,86±0,49; p<0,001). Одноядерных гепатоцитов с интерфазным ядром при 3-й стадии хронизации определялось больше, чем при 2-й (49,34±0,26 и 47,92±0,30; p<0,019).

При анализе энзиматических показателей ткани печени, проведенном по результатам определения активности ферментов в ткани печени 22 детей (12 человек со 2-й и 10 – с 3-й стадиями хронизации), первое, что обращало на себя внимание, это подавление в несколько раз активности ферментов при 3-й стадии хронизации гепатита В по сравнению со 2-й, причем, большинство межгрупповых различий достоверно (табл.1). Вторая особенность внутриклеточного метаболизма ткани печени заключалась в том, что в большей степени снижение активности касалось НАДФ-зависимых ферментов, чем НАД-зависимых (количество достоверных различий показателей в соотношении 5:2).

3-я стадия хронизации, по сравнению со 2-й, сопровождалась снижением активности фермента гликолиза ЛДГ (7,18±2,26 и 23,80±4,59; p<0,011), а также Г6ФДГ – фермента пентозофосфатного пути (7,99±2,36 и 29,95±6,64; p<0,024). Также при 3-й стадии на менее высоком, чем при 2-й, уровне определялась активность ферментов цикла трикарбоновых кислот и ассоциированных с ним реакций: НАДФИЦДГ (соответственно 19,06±5,30 и 57,67±11,59; p<0,005), НАДФГДГ (9,48±4,26 и 35,68±9,04; p<0,029), НАДМДГ (77,75±17,94 и 217,14±48,24; p<0,024), НАДФМДГ (7,90±1,84 и 23,40±4,21; p<0,017), а также ГР, функционирующей в системе глутатионовой антиоксидантной защиты клеток и в активном транспорте в них аминокислот (3,01±0,8 и 18,23±1,70; p<0,024).

С помощью корреляционного анализа установлены взаимосвязи энзиматических и некоторых кариометрических параметров ткани печени больных детей (табл. 2).

Таблица 2

Значения и достоверность коэффициентов ранговой корреляции Спирмена между кариометрическими показателями гепатоцитов и активностью внутриклеточных метаболических ферментов в гомогенате ткани печени

Примечание. Критическое значение коэффициента ранговой корреляции Спирмена при n=22 для уровня достоверности Р<0,05 равно 0,042; для Р<0,01 = 0,54.

Наиболее существенным обстоятельством является то, что максимальное количество достоверных связей определялось между относительным содержанием числа ядер гепатоцитов, находившихся в состоянии деления, и активностью почти всех (за исключением НАДИЦДГ) изученных ферментов цикла Кребса и ассоциированных с ним реакций (НАДФИЦДГ, НАДГДГ, НАДФГДГ, НАДМДГ, НАДФМДГ), а также ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути (ЛДГ и Г6ФДГ). При этом положительное значение коэффициентов корреляции указывало на высокую прямую зависимость митоза гепатоцитов от активности как реакций энергопродукции в цикле трикарбоновых кислот и гликолизе с участием НАД-зависимых ферментов, так и от количества восстановленного НАДФ, вырабатываемого соответствующими НАДФ-зависимыми ферментами и необходимого для пластических и синтетических процессов клеток. Наличие же положительного коэффициента корреляции между числом ядер гепатоцитов в состоянии деления и активностью Г6ФДГ свидетельствовало о наличии прямой зависимости процесса клеточного деления и от работы пентозофосфатного пути, его продуктивности по обеспечению необходимого для деления количества нуклеиновых кислот. Следует отметить, что показатель Г6ФДГ имел максимальное количество достоверных корреляционных связей с морфометрическими показателями, характеризующими репаративные процессы в печени детей, больных хроническим гепатитом В, что подтверждает высокую значимость метаболических реакций пентозофосфатного пути для процессов регенерации.

Несколько отрицательных корреляционных показателей свидетельствовали о том, что при менее высоком уровне метаболизма со сниженной активностью ферментов, в ткани печени определяются более высокими как доля одноядерных гепатоцитов с интерфазным ядром, так и процентное количество клеточных ядер в интерфазе. Эти морфометрические показатели имели обратные связи с активностью ферментов, обеспечивающих и пластические, и энергетические потребности клеток: Г6ФДГ, Г3ФДГ, ЛДГ, НАДМДГ и НАДФИЦДГ.

Применение корреляционного анализа позволило установить взаимосвязи активности метаболических ферментов в ткани печени и с такими показателями, как среднее число ядрышек в ядре гепатоцитов и объем ядрышкового материала. Для первого из них установлена прямая взаимозависимость с Г6ФДГ – ключевым ферментом пентозофосфатного пути, а также с НАДИЦДГ – ферментом цикла трикарбоновых кислот. Показатель объема ядрышкового материала имел связи с большим числом ферментов, функционирующих как в цикле Кребса, так и в пентозофосфатном пути: НАДИЦДГ, НАДФИЦДГ, НАДГДГ, НАДФМДГ и Г6ФДГ. Перечисленные положительные связи вполне объяснимы тем, что количество ядерного материала и число ядрышек в гепатоците зависят от способности метаболизма обеспечить как энергетические, так и пластические потребности клеток.

Таким образом, в результате проведения комплексного исследования впервые установлены взаимосвязи между морфологическими и метаболическими параметрами ткани печени у детей, больных хроническим вирусным гепатитом В, которые раскрывают некоторые клеточные и субклеточные механизмы повреждения и регенерации печени при этом заболевании.

Выводы

1. Интенсивность энергетических и пластических реакций в клетках печени у детей в возрасте 12-16 лет, больных хроническим вирусным гепатитом В, зависит от стадии хронизации заболевания. Повышение стадии хронизации заболевания приводит к более выраженному поражению паренхиматозных структур печени, что сопровождается ингибированием внутриклеточных ферментов.

2. Корреляционные связи между энзиматическими показателями ткани печени и кариометрическими параметрами гепатоцитов отражают субклеточные механизмы повреждения и регенерации печени при хроническом вирусном гепатите В у детей.