Рак молочной железы не перестает занимать лидирующие позиции среди онкологических заболеваний у женщин [4]. Те или иные формы прогрессии зачастую становятся причиной гибели. В настоящее время актуальным является поиск новых подходов к прогнозированию течения этого заболевания. Известно, что ключевым фактором метастатического потенциала опухоли является состояние его микроокружения. Kohrt et al. [2005] показали, что при раке молочной железы присутствие опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов в высоком CD4+/CD8+ и Th2/Th1 соотношении является плохим прогностическим показателем [6]. J. Galon et al. ввели такое понятие как Immunoscore, где в качестве прогностического признака используется определение соотношения CD3/CD8 в инвазивном крае и центре опухоли [5]. Дальнейшие исследования подтверждали показанное ранее, так, при масштабных исследованиях транскриптома опухоли было продемонстрировано, что благоприятным для исхода болезни является местный Th1-ответ, ведущий к цитотоксическому уничтожению клеток опухоли [7]. Однако в литературе встречаются и противоположные данные, возможно, в силу явления внутриопухолевой гетерогенности [2], одним из проявлений которой является морфологическая гетерогенность [1]. Ранее было показано, что наличие различных морфологических структур в опухоли молочной железы имеет разное прогностическое значение и связь с вариантами прогрессии [3]. В настоящей работе было изучено наличие и распределение цитотоксических Т-лимфоцитов в строме различных структур инвазивного компонента рака молочной железы, а также проанализирована связь с прогрессией опухоли (рецидивированием, лимфогенным и гематогенным метастазированием).
Материалы и методы исследования
В исследование были включены 54 больных с инвазивным раком молочной железы неспецифического типа в возрасте от 37 до 80 лет, средний возраст составил 54,9 ± 9,7 года. Пациенты были разделены на четыре группы: 1 – без каких-либо форм прогрессии (n = 16), 2 – с лимфогенным метастазированием (n = 9), 3 – с гематогенным метастазированием (n = 8), 4 – с наличием рецидива (n = 7). Предоперационного лечения больные не получали. Среди пациентов 59,5 % имели люминальный А тип, 14,3 % – люминальный В тип, 16,7 % – трижды негативный тип, 9,5 % – тип с гиперэкспрессией Her2neu. Всем больным проводилась операция в размере радикальной мастэктомии и секторальной резекции молочной железы. По соотношению разных молекулярно-генетических типов и вида проведенного хирургического лечения группы не различались. Образцы тканей фиксировались в 10 % нейтральном формалине. Материал обрабатывался по стандартной методике и заливался в парафин. Морфологическое исследование операционного материала осуществлялось по стандартной методике с использованием светового микроскопа «CarlZeissAxio Lab.A1». Гистологический тип рака устанавливался согласно рекомендациям ВОЗ (Женева, 2012). Наличие цитотоксических Т-лимфоцитов в строме опухоли оценивали по иммуногистохимическому окрашиванию клеток, формирующих микроокружения тубулярных, альвеолярных, солидных, трабекулярных структур и дискретно расположенных групп клеток (ГК), антителами против CD45, CD3, CD8. При исследовании применяли антитела фирмы «Dako» к CD 3 (клон UCHT1, рабочее разведение 1:100), к CD8 (клон C8/144B, рабочее разведение 1:100),фирмы «Biogenex» к CD45LCA (клон PD7/26/16&2B1, RTU, мышиные). Экспрессию СD 45, СD 3, СD 8 в клетках воспалительного инфильтрата оценивали полуколичественно (0 баллов – отсутствие; 1 балл – 1–5 клеток; 2 балла – 6–20 клеток; 3 балла – более 20 клеток) вблизи каждого варианта структур паренхиматозного компонента опухоли (не далее чем на 2 диаметра малого лимфоцита), а также в строме новообразования в отдалении от паренхиматозных структур. Отдаленные результаты оценивались через 5 лет. Статистическая обработка проводилась с использованием пакета программ «Statistica 6.0 for Windows». Проверка на соответствие нормальному закону распределения проводилась с использованием критерия Шапиро-Уилка. Для проверки гипотезы применялся критерий Краскала-Уолиса. Результаты считались достоверными при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Подсчитанное в соответствии с рекомендациями J. Galon et al. соотношение CD3/CD8 оказалось выше в группе пациенток с рецидивами рака молочной железы в сравнении со случаями без прогрессии болезни. Причем результат не зависел от того проводился ли подсчет количества соответствующих лимфоцитов в случайных полях зрения или в отдалении от опухолевых структур (соответственно: 0,911 ± 0,946 и 1,260 ± 0,240, р = 0,003; 0,940 ± 0,150 и 1,430 ± 0,730, р = 0,006). При анализе общего количества CD45LCA+ лейкоцитов и CD8+ лимфоцитов в воспалительном инфильтрате в зависимости от формы прогрессии были обнаружены достоверные различия. Показано, что наличие СD45LCA+ лейкоцитов и CD8+ лимфоцитов в инфильтрате вне зависимости от типа морфологических структур было достоверно выше в группе пациентов без рецидива (3,05 (2,55–3,95) и 2,80 (2,00–3,30) усл.ед., соответственно) по сравнению с группой пациентов, имеющих рецидив (2,12 (1,76–2,71) и 1,50 (1,20–2,22) усл.ед., соответственно) (р = 0,008 и р = 0,027, соответственно).
Далее, для того, чтобы определить вклад морфологической гетерогенности опухоли в выявленные различия, нами было определено содержание CD3+, CD45LCA+, CD8+ клеток и соотношение CD3/CD8 в воспалительном инфильтрате вблизи каждого из пяти типов структур инфильтративного компонента опухоли (тубулярных, альвеолярных, солидных, трабекулярных и дискретно расположенных групп клеток) в зависимости от формы прогрессии. Было обнаружено, что в группе больных без рецидива количество CD45LCA+ и CD8+ клеток в инфильтрате вокруг ГК и CD8+ клеток в инфильтрате в отдалении от опухолевых структур повышалось (3,00 (2,00–4,00); 3,00 (2,50–4,00) и 4,00 (3,00–4,00) усл.ед., соответственно) по сравнению с аналогичными показателями группы больных с наличием рецидивов (2,00 (1,00–2,00); 1,00 (1,00–2,00) и 2,00 (2,00–2,75) усл.ед., соответственно) (р = 0,011, р = 0,019 и р = 0,001, соответственно). С наличием гематогенных метастазов было ассоциировано достоверное снижение количества CD45+ и CD8+ лимфоцитов до 1,00 (1,00–2,00) и 1,00 (1,00–2,00) усл.ед., соответственно, вблизи дискретно расположенных опухолевых клеток (р = 0,018 и р = 0,017, соответственно). Соотношение CD3/CD8 вблизи разных структур не различалось в группах с наличием рецидивов или гематогенных метастазов в сравнении с контрольной группой (p > 0,05).
Лимфогенное метастазирование не было связано с инфильтрацией стромы CD3+, CD45LCA+ и CD8+ клетками (p > 0,05).
Заключение
Предлагаемое соотношение CD3/CD8 оказалось эффективным только для прогноза рецидивов. Причем такой прогноз не зависел от морфологической гетерогенности опухоли. Оказалось, что для оценки риска возникновения рецидивов и гематогенных метастазов опухоли достаточно определение CD45LCA+ или CD8+ клеток в микроокружении дискретно расположенных опухолевых клеток и CD8+ клеток в инфильтрате в отдалении от каких-либо опухолевых структур. Из всех типов структур инвазивного компонента опухоли, только характер иммуно-воспалительной инфильтрации вблизи дискретно расположенных опухолевых клеток оказался связанным с рецидивированием и гематогенным, но не с лимфогенным метастазированием. Выявленное снижение инфильтрации лейкоцитами и количества цитотоксических Т-лимфоцитов в строме опухоли у пациентов, имеющих рецидив или гематогенные метастазы, может свидетельствовать в пользу важной роли дискретных опухолевых клеток и иммуно-воспалительной реакции Th1-CD8 типа в развитии и торможении рецидивирования и метастазирования инвазивного рака молочной железы неспецифического типа.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 15-34-20864 мол_а_вед.