Проблема лечения ортопедо-травматологической патологии, осложненной хронической гнойной инфекцией, остается актуальной до настоящего времени.
Остеомиелит диагностируется после открытых переломов в 3–24 % наблюдений и в 1–7 % после оперативного лечения закрытых переломов. При этом рецидивы остеомиелита отмечаются у 20–30 % больных, что приводит к функциональной неполноценности конечности в 10,3–57 % наблюдений [2, 10].
Возникновение, развитие и течение гнойного процесса определяется сочетанием многих факторов, среди которых ведущим является взаимодействие защитных сил организма и проникших микробов. В настоящее время основными возбудителями хронического посттравматического остеомиелита являются монокультуры и ассоциации Staphylococcus aureus с грамотрицательными микроорганизмами [3].
Выявлена связь воспалительного процесса при остеомиелите с динамикой показателей естественной резистентности в тканях [5].
Влияние хронической инфекции на фагоцитарную активность нейтрофилов и лизоцимную активности сыворотки крови при лечении методом чрескостного остеосинтеза остается малоизученным.
Целью настоящей работы явилась оценка неспецифического звена иммунитета у больных с хроническим остеомиелитом нижних конечностей в зависимости от выявленной микрофлоры.
Материалы и методы исследования
В дооперационном периоде обследовано 52 пациента со свищевой формой хронического посттравматического остеомиелита нижних конечностей в стадии обострения, находившихся на хирургическом лечении в клинике РНЦ «ВТО» им акад. Г.А. Илизарова в период с 2011 по 2013 гг. Возраст обследованных больных находился в пределах от 20 до 55 лет, длительность заболевания варьировала от 3 до 15 лет.
Были проанализированы результаты микробиологического исследования патологического материала. В качестве объекта исследования в работе было использовано отделяемое из ран, свищей (в дооперационном периоде). Микробиологические исследования выполняли традиционным методом посева на плотные питательные среды. Идентификация бактерий проводилась как в соответствии с общепринятыми рекомендациями, так и при помощи баканализатора «WalkAway-40 Plus» («Siemens») с использованием микротест – систем. Анализ данных исследуемых штаммов осуществлялся при помощи аналитической компьютерной программы WHONET 5,6.
Применялась стандартная методика изучения фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН), основанная на количественном определении поглотительной и переваривающей способности нейтрофилов по отношению к микробной тест – культуре (Staphylococcus epidermidis штамм № 9198 НИИЭМ). Рассчитывались следующие показатели ФАН: фагоцитарный показатель (ФП, %), фагоцитарное число (ФЧ, %); количество активных фагоцитов (КАФ,(109/л)); абсолютный фагоцитарный показатель (АФП, (109/л)). Кислородзависимую метаболическую активность нейтрофильных гранулоцитов оценивали в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ – тест) по методу Park, в двух вариантах: спонтанном и стимулированном. Лизосомальную активность нейтрофилов определяли, используя цитохимическое исследование клеток. Активность миелопероксидазы (МП) определялась по Грехему – Кнолю. Уровень лизосомальных катионных белков (КБ) цитоплазмы устанавливали в реакции с бромфеноловым синим. Уровень МП и КБ выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Для подсчета нейтрофильных ловушек использовали мазки крови, окрашенные по Романовскому – Гимза. Учет ФАН производился при помощи световой микроскопии под иммерсией, исходя из 100 подсчитанных нейтрофилов.
Оценку лизоцимной активности сыворотки крови (ЛАСК) проводили по методике Стогний В. И. и соавт. Забор крови осуществлялся из локтевой вены натощак.
В качестве контрольных использовались иммунологические показатели 21 относительно здоровых добровольца из числа сотрудников в возрасте от 25 до 55 лет. Все лица, участвовавшие в исследовании дали информированное согласие на публикацию данных, полученных в результате исследования, без идентификации личности. На проведение клинических исследований получено разрешение комитета по этике ФГБУ «РНЦ» «ВТО им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России».
Полученные данные обрабатывались с помощью методов непараметрической статистики с использованием U-критерия Вилкоксона и были представлены в виде М ± m. Различия считались достоверными при p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
По результатам микробиологического исследования пациенты были распределены на 2 группы. В I группе пациентов (n = 27) микробный пейзаж раневого отделяемого представлен монокультурой – S. aureus, во II группе (n = 25) – двух – трех компонентными ассоциациями микроорганизмов.
В ассоциациях микроорганизмов выявлен следующий видовой состав: стафилококки – S. aureus, S. hominis, S. epidermidis, S. warneri; стрептококки – Streptococcus intermedius, грамотрицательные микроорганизмы – Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus; анаэробные бактерии – Finegoldia magna, Peptostreptococcus asaccharolyticus [рисунок].
Анализ полученных данных показал следующее: нейтрофилы в обеих группах независимо от микробного пейзажа показали высокую фагоцитарную активность (р ≤ 0,01) по сравнению с контрольной группой (табл. 1).
Однако, наиболее выраженные изменения со стороны показателей ФАН отмечались в группе пациентов со смешанной микрофлорой в раневом отделяемом. У данной группы больных большинство исследованных показателей (ФП, ФЧ, КАФ, АФП) были достоверно выше, чем в контроле (табл. 1). В группе пациентов, у которых из ран высевались микробные ассоциации, наибольшую активность проявили кислородзависимые факторы бактерицидной активности нейтрофилов – миелопероксидаза и кислородные радикалы (НСТ – тест). Величина НСТ – теста в обоих вариантах у пациентов с ассоциациями достоверно превышала контрольные значения. Та же самая тенденция наблюдалась и в отношении кислородзависимой лизосомальной активности нейтрофилов – МП. Данный показатель во второй группе имел достоверные отличия не только с контролем, но и с первой группой, где в ранах превалировал золотистый стафилококк.
Микробный пейзаж раневого отделяемого у больных II группы
Таблица 1
Показатели неспецифической резистентности у больных хроническим остеомиелитом в зависимости от выявленной микрофлоры
|
Показатель |
I группа – S. aureus |
II группа – микробные ассоциации |
Контрольная группа |
|
ФП ( %) |
87,5 ± 1,70 |
91,6 ± 1,13+ |
71,0 ± 1,27 |
|
ФЧ (у.е.) |
9,4 ± 0,65+ |
9,7 ± 0.64+ |
7,3 ± 0,18 |
|
КАФ(109/л) |
4,4 ± 0,48++ |
5,2 ± 0,70++ |
2,3 ± 019 |
|
АФП(109/л) |
45,2 ± 4,46++ |
51,0 ± 4,11++ |
24,0 ± 1,99 |
|
НСТ спонт. ( %) |
7,7 ± 1,52 |
8,4 ± 1,29+ |
5,6 ± 0,32 |
|
НСТ стим. ( %) |
71,0 ± 4,11+ |
76,0 ± 4,45+ |
54,0 ± 1,87 |
|
МП(СЦК) |
2,0 ± 0,11 |
2,5 ± 0,10*+ |
2,1 ± 0,05 |
|
КБ (СЦК) |
2,3 ± 0,06 |
2,3 ± 0,10 |
2,0 ± 0,04 |
|
ЛАСК ( %) |
83,3 ± 1,2 |
83,2 ± 2,7 |
83,8 ± 0,2 |
|
НВЛ ( %) |
5,1 ± 0,63++ |
5,7 ± 1,42++ |
1,0 ± 0,2 |
Примечание. + – р ≤ 0,05, ++ – р ≤ 0,01 – относительно показателей контрольной группы; * – р ≤ 0,05 – относительно показателей I группы.
Кислороднезависимая лизосомальная активность нейтрофилов (КБ, ЛАСК) в обеих исследованных группах оставалась в пределах значений показателей контроля.
В обеих группах больных наблюдалось усиление недавно открытого механизма внеклеточного киллинга – образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ). Содержание НВЛ у больных с гнойной инфекцией значительно превысило контрольные значения. По количеству образуемых нейтрофильньных ловушек достоверных различий между I и II группой не зафиксировано.
Интересные данные были получены при разделении II группы на подгруппы:
1) двухкомпонентные ассоциации – в состав которых входили стафилококки (в основном S. aureus) и грамотрицательные микроорганизмы (Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens);
2) трехкомпонентные ассоциации – в их составе было выявлено не менее трех штаммов различных бактерий, обязательно присутствовал S. aureus, а так же встречались грамотрицательные бактерии (Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Acinetobacter baumannii, Bacillus cereus) и прочие микроорганизмы (Streptococcus intermedius, S. warneri, Finegoldia magna, Peptostreptococcus asaccharolyticus).
В обеих подгруппах наблюдались однонаправленные изменения показателей ФАН – эффекторная и метаболическая функции нейтрофилов находились на высоком уровне в сравнении с контролем (табл. 2).
Наибольшие достоверные отличия выявлены в отношении показателей лизосомальной активности нейтрофилов (МП, КБ): у больных с 2 – х компонентными ассоциациями величина данных показателей значительно (р ≤ 0,01) превышала контрольные значения.
Для обеих подгрупп была характерна высокая активность внешнего киллинга (образование НВЛ). Однако, у пациентов с 3 – х компонентными микробными ассоциациями способность к образованию ловушек была более выражена, чем в контроле и во 2 – й подгруппе.
По нашим данным, у больных остеомиелитом золотистый стафилококк высевался не только в монокультуре, а также присутствовал в большинстве ассоциаций наряду с грамотрицательной микрофлорой. Наши данные полностью согласуются с ранее проведенными исследованиями и с исследованиями других авторов [3, 7].
Важным этапом процесса фагоцитоза является киллинг поглощённых бактерий в фагоцитирующих клетках, обеспечивающийся кислородзависимыми и кислороднезависимыми механизмами, которые играют ведущую роль в уничтожении поглощенных микроорганизмов, и, в конечном итоге, в защите макроорганизма от инфекций [6].
Эффективность этих механизмов бактерицидности зависит от свойств микроба и условий его контакта с фагоцитом. Известно, что золотистый стафилококк, так и грамотрицательные симбионты, находящиеся с ним в выделенных ассоциациях, обладают рядом факторов, которые разрушают активные формы кислорода, а также обладают атилизоцимной активностью и устойчивостью к катионным белкам. При фагоцитозе изменяется экспрессия многих генов золотистого стафилококка, в том числе повышается синтез токсинов [1, 9].
Таблица 2
Показатели неспецифической резистентности у больных хроническим остеомиелитом в зависимости от состава микробных ассоциаций
|
Показатель |
2-х компонентные ассоциации |
3-х компонентные ассоциации |
Контрольная группа |
|
ФП ( %) |
89,0 ± 0,99++ |
94,2 ± 0,63++ |
71,0 ± 1,27 |
|
ФЧ (у.е.) |
8,8 ± 0,92 |
10,7 ± 0,63+ |
7,3 ± 0,18 |
|
КАФ (109/л) |
6,2 ± 1,03++ |
4,1 ± 0,24+ |
2,3 ± 019 |
|
АФП (109/л) |
55,3 ± 7,82++ |
46,8 ± 2,32+ |
24,0 ± 1,99 |
|
НСТ спонт. ( %) |
7,8 ± 1,65 |
9,2 ± 2,25+ |
5,6 ± 0,32 |
|
НСТ стим. ( %) |
80,4 ± 3,81++ |
70,5 ± 7,71+ |
54,0 ± 1,87 |
|
МП(СЦК) |
2,7 ± 0,06++ |
2,4 ± 0,13 |
2,1 ± 0,05 |
|
КБ (СЦК) |
2,4 ± 0,13+ |
2,1 ± 0,08 |
2,0 ± 0,04 |
|
НВЛ ( %) |
3,2 ± 0,40 |
8,2 ± 1,44*++ |
1,0 ± 0,2 |
Примечание. * – р ≤ 0,05 относительно показателей больных с 2 – х компонентными ассоциациями; + – р ≤ 0,05, ++ – р ≤ 0,01 показателей контрольной группы.
Как показали наши исследования, фагоцитарный потенциал нейтрофилов у больных остеомиелитом был довольно высок, особенно кислородзависимые механизмы киллинга. Несмотря на это, заболевание продолжало прогрессировать [4].
Можно предположить, что при наличии достаточного количества бактерицидных факторов, нейтрофилы работают на пределе своих возможностей. Однако, микробы довольно легко разрушают большую часть образующихся активных форм кислорода и успешно инактивируют лизоцим и катионные белки [8].
Несмотря на это, нейтрофильные фагоциты пытаются до конца использовать весь свой арсенал для борьбы с инфекцией. Вторым защитным механизмом нейтрофилов является выделение содержимого гранул во внеклеточное пространство – образование нейтрофильных внеклеточных ловушек. Наибольший стимулирующий эффект на образование НВЛ оказали 3 – х компонентные ассоциации, тогда как большей киллинговой активностью, скорее всего, обладали НВЛ у пациентов с 2 – х компонентными ассоциациями. У данной группы в фагоцитах содержалось большее количество лизосомальных ферментов.
Выводы
Таким образом, проведенные лабораторные исследования показали, что у больных с хроническим посттравматическим остеомиелитом длинных трубчатых костей основным возбудителем является S. aureus, который выделяется как в монокультуре, так и в ассоциации с другими микроорганизмами. Показано, что ФАН меняется в зависимости от видового состава микрофлоры. Проведенное сравнительное исследование позволило установить, что увеличение количества штаммов в микробных ассоциациях усиливает фагоцитарно – метаболическую и ловушкообразующую активность нейтрофилов. Комплексное исследование микробного пейзажа и факторов врожденного иммунитета может быть использовано для диагностики течения инфекционного процесса.