Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Chlamydia Trachomatis (Ch. Trachomatis) – широко распространенный возбудитель, вызывающий не только заболевания мочеполовой системы, глаз, но и инфекционных артритов [2]. Хламидии представляют собой облигатные внутриклеточные патогены клеток эукариот, для которых характерен специфический двухфазный цикл развития, предполагающий возможность формирования как метаболически активных ретикулярных телец (РТ), так и неактивных элементарных телец (ЭТ). На основании различий антигенной структуры основного протеина внешней мембраны, Ch. Trachomatis разделены на 3 биоварианта с различным органотропизмом: серовары А, В, Ва, С вызывают инфекционные заболевания глаз; серовары D, E, F, G, H, I, J, K являются причиной заболеваний, передающихся половым путем; серовары L1, L2, L3 – этиологический фактор венерической лимфогранулемы [12]. В то же время, геном различных сероваров Ch. Trachomatis идентичен на 99 %, а различия наблюдаются лишь в небольшом его участке (около 50 kb). При инфицировании Ch. Trachomatis поражают эпителиальные клетки, присоединяясь к ним и проникая в цитоплазму, образуя мембраносвязанную везикулу, внутри которой ЭТ подвергаются 7–8 делениям, в результате чего формируются РТ, до 80 % которых далее вновь дедифференцируются в ЭТ. В клетке Ch. Trachomatis локализуются внутри изолированных вакуолей, окруженных мембраной, в которых они недосягаемы для лизосомальных ферментов [3]. Было установлено, что диссеминация Ch. Trachomatis из первичного очага заражения обусловлена их инфильтрацией в полиморфноядерные лейкоциты в активной фазе инфекции, и моноциты в хронической ее фазе [11]. Следовательно, циркулирующие моноциты переносят патоген и инициируют как воспаление, так и иммунный ответ на инфекцию. Дендритные клетки, являясь профессиональными антиген – презентирующими клетками, также инфицируются Ch. Trachomatis, что сопровождается экспрессией ко-стимуляторных молекул, и секрецией провоспалительных цитокинов [4, 6]. Подавление пролиферации хламидий осуществляется γ-интерфероном и ФНО-α, стимулирующими продукцию индоламина 2,3-диоксигеназы (ИДО), энзима, катализирующего деградацию триптофана [10]. Причем функционально активная триптофан-синтаза, ген обеспечивающий бактерии возможность использования индола как субстрата для синтеза триптофана, когда внутриклеточный синтез триптофана подавлен ИДО, обнаружена только в сероварах, вызывающих заболевания мочеполовой системы и отсутствует в таковых, индуцирующих заболевания глаз, что, по – видимому, и обусловливает органотропизм хламидий [9]. Для хламидий характерна способность к длительной персистенции – поддержанию жизнеспособности без продукции инфекционных телец, как в моноцитах, так и в дендритных клетках человека, что сопровождается увеличением экспрессии гена Ct604, кодирующего белок теплового шока hsp 60, который вовлечен в поддержание состояния персистенции [2, 4].

Исследованиями последних лет было установлено, что Ch. Trachomatis, которые ранее рассматривались как этиологический фактор реактивных (стерильных) артритов, возникающих у некоторых больных после урогенитальной хламидицной инфекции, способны в течение многих лет персистировать в моноцитах синовиальной ткани сустава [1, 5], что обусловливает необходимость дифференцированного подхода к терапии хламидия – ассоциированных артритов. Согласно современным представлениям, при развитии реактивного хламидия – ассоциированного артрита происходит формирование асептического воспаления в синовиальной ткани сустава, индуцированного инфекцией в мочеполовой системе, как правило, у генетически предрасположенных индивидуумов – носителей генов HLA-B27, HLA-B39, HLA-B60, HLA-DRI. Как правило, данные артриты характеризуются сочетанием несимметричного периферического иммуноопосредованного поражения сустава с сакроилеитом и экстраарткулярными проявлениями в виде увеита, псориаза, неспецифического язвенного колита, при отсутствии в крови ревматоидного фактора [7]. При инфекционном хламидия – индуцированном артрите синовиальная ткань не является стерильной, в ней обнаруживаются персистирующие Ch. Trachomatis, у которых происходит остановка цикла развития микроорганизма на поздней стадии формирования ЭТ, количество которых снижается, и образуются аберрантные формы РТ. Хламидии в состоянии персистенции характеризуются высокой резистентностью к антибактериальной терапии, причем среди биовариантов Ch. Trachomatis, персистенция в синовиальной ткани характерна для сероваров, вызывающих заболевания глаз, что, как предполагается, обусловлено более эффективной диссеминацией этих сероваров из очага первичного инфицирования [2].

Несмотря на то, что способность Ch. Trachomatis к персистенции в моноцитах синовиальной ткани сустава в настоящее время убедительно доказана, иммунный статус больных при данном виде артритов остается практически неизученным.

На основании изложенного выше, целью данного исследования было выявить иммунологические особенности хронического артрита, ассоциированного с Ch. Trachomatis.

Материалы и методы исследования

В исследование были включены 24 больных из числа пациентов клиники ФГБУ «Новосибирский НИИТО» им. Я.Л. Цивьяна, 10 мужчин и 14 женщин в возрасте 46–67 лет с установленным диагнозом коксартроза, с длительностью заболевания от 11 до 28 лет, поступивших в клинику для проведения операции первичного тотального замещения тазобедренного сустава (ТБС) эндопротезом. Эксперименты проводили с соблюдением «Этических принципов проведения научных медицинских исследований с участием человека», в соответствии с приказом Минздрава РФ № 266 (Правила клинической практики в Российской Федерации) от 19.06.2003 г. Согласно современным диагностическим критериям, ни у одного из включенных в исследование больных артрит не был реактивным, а рассматривался как идиопатический.

Среда для культивирования мононуклеарных клеток крови (МНК): RPMI-1640 (ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская область, п. Кольцово), содержащая 5 % сыворотки крови человека АВ (IV) (Новосибирский центр крови), 10мМ Hepes (ICN Biomedicals Inc, Aurora,Ohio), 4x10-5М ²-меркаптоэтанола (L.Oba Feinchemie, Fischamene), 2 Мм L-глутамина (ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская область, п. Кольцово), 40 мкг/мл гентамицина (ФГУП НПО «Вирион»).

Выделение и культивирование МНК: Венозную кровь с добавлением гепарина (20 ед / мл), полученную за 1 сутки до проведения операции, центрифугировали на градиенте плотности фиколла 1,078 г/см³ (Lymphocyte separation medium, MP Biomedicals, LLC, Eschwege, Germany) при 1500 оборотов/мин. в течение 40 мин. Клетки, собранные из интерфазы, и представленные на 96 % лимфоцитами и моноцитами, отмывали и осаждали центрифугированием. МНК культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в концентрации 1х10⁶/мл при 37 °С в атмосфере, содержащей 5 % СО₂ и 95 % влажности в течение 72 часов.

Оценка пролиферативной активности МНК: Для индукции поликлональной активации клеток использовали Т- и В-клеточные митогены в субоптимальных концентрациях, которые составили для ConA (Sigma) 2 мкг/мл, PWM (Sigma) 5 мкг/мл, РНА (Sigma) 10 мкг/мл. Пролиферативную активность МНК определяли стандартным методом, по включению радиоактивной метки (Н3 тимидин). Количественные показатели пролиферации представляли в абсолютных (имп/мин) и относительных величинах, в виде индексов влияния, рассчитанных как частное от деления показателя индуцированной пролиферации на показатель спонтанной пролиферации.

Детекция ДНК Ch. trachomatis проводилась методом полимеразной цепной реакции. МНК и образцы синовиальной ткани, полученные интраоперационно из области переходной складки ТБС, измельчали и гомогенизировали. Прилипающие клетки, представленные преимущественно макрофагами, получали методом адгезии к пластику, как описано ранее [1]. ДНК из них, а также из МНК крови выделяли с использованием тест – системы ВектоДНК – экстракция – 3 (Вектор – Бест, Новосибирск). Амплификацию полученной ДНК осуществляли с использованием пар олигонуклеотидных праймеров, гомологичных консервативным участкам антипараллельных цепей ДНК Ch. trachomatis. («ВектоХлами – ДНК – ампли – 100)», Вектор – Бест, Новосибирск), в программируемом амплификаторе «Терцик» (ДНК – технологии, Москва). Продукты амплификации анализировали методом электрофореза в 1 % геле агарозы с добавлением бромистого этидия (ВектоДНК – ЭФ, Вектор – Бест, Новосибирск). Положительными считали образцы с наличием в геле видимой полосы ДНК, соответствующей по длине ДНК контрольного образца (501 пара нуклеотидов)

Статистическую обработку данных проводили с применением методов описательной статистики, сравнительного анализа, при помощи непараметрического U – критерия Манна – Уитни для двух независимых групп, с использованием коммерческого пакета программ «Statistica 7.0» (StatSoft, USA). Результаты представляли в виде медианы и интервала между 1 и 4 квартилями (Ме (25 %; 75 %). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

На основании исследования инфицированности синовиальной ткани, больные коксартрозом были разделены на 2 группы. Контрольную группу составили пациенты, в макрофагах синовиальной ткани которых ДНК Ch. Trachomatis обнаружена не была. Больные же, инфицированные Ch. Trachomatis, составили группу исследования. Больные данных групп не отличались по показателям общеклинических лабораторных исследований (общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимическое исследование крови (общий белок, фибриноген, ревматоидный фактор).

Так как спонтанная и индуцированная митогенами пролиферация МНК является одним из параметров, характеризующих состояние иммунной системы, мы провели сравнительное исследование показателей пролиферации МНК больных обеих групп. Поскольку моноциты рассматриваются как клетки, способные к переносу хламидий из очага инфицирования, как было показано выше, в серии предварительных экспериментов мы изучали наличие ДНК Ch. Trachomatis в МНК периферической крови больных. Было установлено, что у больных коксартрозом, включенных в исследование, ДНК Ch. Trachomatis в МНК крови не выявляется.

При изучении спонтанной пролиферации МНК, было установлено, что группа больных коксартрозом, инфицированных Ch. Trachomatis, характеризуется значительно более высоким ее уровнем (табл. 1).

Таблица 1

Показатели спонтанной пролиферации мононуклеарных клеток крови у больных коксартрозом (Ме (25 %; 75 %) имп/мин

Примечание. 1 – инфицированные Ch. Trachomatis, n = 11; 2 – не инфицированные Ch. Trachomatis , n = 13; * – статистическая значимость различий между группами (p < 0,05, H-критерий Крускала – Уоллиса); ** – статистическая значимость различий между группами (p < 0,01, U – критерий Манна – Уитни).

Известно, что повышение спонтанной пролиферации лимфоцитов коррелирует с наличием воспаления [8]. Выявленный нами высокий уровень спонтанной пролиферации МНК у группы больных, инфицированных Ch. Trachomatis, несмотря на отсутствие различий в общеклинических лабораторных показателях с больными контрольной группы, свидетельствует о наличии у них хронического воспалительного процесса, возможно, вызванного хламидийной инфекцией в синовиальной ткани, что было обнаружено нами ранее при ее морфологическом исследовании [1].

Таблица 2

Показатели пролиферации мононуклеарных клеток крови у больных коксартрозом (Ме (25 %; 75 %), ИВ

Примечание. 1 – инфицированные Ch. Trachomatis, n = 11; 2 – не инфицированные Ch. Trachomatis , n = 13; * – статистическая значимость различий между группами (p < 0,05, H-критерий Крускала – Уоллиса); ** – статистическая значимость различий между группами (p < 0,01, U – критерий Манна – Уитни).

При исследовании ответа иммунокомпетентных клеток больных на митогены, было установлено, что МНК крови больных обеих групп отвечали на воздействие митогенами выраженной пролиферацией клеток. Причем уровень стимулированной пролиферации МНК как на Т-, так и на В-клеточные митогены больных, не инфицированных Ch. Trachomatis, соответствовал нормальным значениям и значительно превышал таковой инфицированных больных (табл. 2).

Снижение ответа на поликлональную активацию как Т-, так и В-клеточными митогенами МНК крови инфицированных Ch. Trachomatis больных свидетельствует о недостаточности у них как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета.

Таким образом, больные хроническим инфекционным артритом, на примере коксартроза, ассоциированного с Ch. Trachomatis, характеризуются более высоким уровнем спонтанной пролиферации МНК крови. При стимуляции пролиферативной активности этих клеток как Т-клеточными митогенами, индуцирующими поликлональную активацию преимущественно Т-лимфоцитов, так и В-клеточным, индуцирующим, соответственно, преимущественно В-лимфоциты, было выявлено, что ответ на митогенное воздействие МНК инфицированных больных значительно снижен, по сравнению с таковым неинфицированных.

Заключение

В проведенном нами исследовании пролиферативной активности МНК крови больных коксартрозом, ассоциированным с Ch. Trachomatis, было выявлено, что иммунный статус данных больных отличается от такового неинфицированных, по параметрам спонтанной и митоген – стимулированной пролиферации МНК, что свидетельствует о наличии у данной группы больных хронического воспаления в суставе и снижении клеточного и гуморального звена иммунитета. Полученные нами данные обусловливают необходимость более глубокого исследования иммунологических параметров у данной категории больных с целью дифференцированного подхода к терапии и прогнозирования степени риска развития послеоперационных инфекционных осложнений при протезировании тазобедренного сустава.