Процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ) является важной причиной накопления клеточных дефектов. Основным субстратом ПОЛ являются полиненасыщенные цепи жирных кислот, входящих в состав клеточных мембран, а также липопротеинов. Их атака кислородными радикалами приводит к образованию гидрофобных радикалов, взаимодействующих друг с другом [1–3]. В результате такого взаимодействия в клетки могут проникать вода, ионы натрия, кальция, что приводит к набуханию клеток, органелл и их разрушению. Активация перекисного окисления характерна для многих заболеваний: дистрофии мышц (болезнь Дюшена), болезни Паркинсона, при которых ПОЛ разрушает нервные клетки в стволовой части мозга, при атеросклерозе, развитии опухолей [4]. Поиск веществ регулирующих активность ПОЛ является одной из актуальных научных проблем.
Влияние аллогенных мононуклеарных клеток, введенных в вену, на активность ПОЛ мозговой ткани фактически не изучено, тем более в разные сроки после трансплантации, хотя именно этот аспект проблемы представляет огромный практический интерес.
Материалы и методы исследования
После декапитации у животных брали кровь и производили забор головного мозга. Для предотвращения свертывания крови в качестве антикоагулянта вводили гепарин (500 МЕ/кг внутривенно). Для получения гомогената нервной ткани, мозг гомогенизировали – pH 7.4 на холоде с помощью гомогенизатора типа «Ultra Turrax». После этого гомогенат центрифугировали при 6000 g [5]. В полученных супернатантах определяли уровень перекисного окисления липидов по содержанию промежуточных (диеновые коньюгаты) и конечных (малоновый диальдегид) [6]. Содержание оксида азота NO определяли по методу [7]. Согласно методике на первом этапе NO3- восстанавливали до NO2- используя металлический кадмий. Затем, используя реактив Грисса, проводили спектрофотометрию при длине волны 546 нм. Для оценки степени восстановления нитритов в нитраты строили калибровочную кривую.
Для получения мононуклеарной фракции использовали аспират костного мозга бедренной кости 3х-мес крыс. Костный мозг заготавливали, аспирируя клетки из полостей трубчатых костей. Дальнейшее очищение состояло из удаления фрагментов кости фильтрацией и изоляции лейкоцитарного слоя (buffy-coat) после центрифугирования. Выделение мононуклеарной фракции из донорского костного аспирата проводили по методу Boyum [8].
Полученные результаты статистически обрабатывали с использованием программы Microsoft Excel и изменения параметров с учетом непарного критерия Фишера – Стьюдента и считали достоверными при р ≤ 0,05. Также использовали непараметрические тесты Манна-Уитни. Результаты представлены в виде M ± m, где М – среднее значение, m – ошибка среднего, p – уровень значимости: p ≤ 0,05 при сравнении всех групп с контрольной группой.
Результаты исследований и их обсуждение
После трансплантации МНК определяли уровень малонового диальдегида (МДА), диеновых коньюгат (ДК) и оксида азота на 30, 60 и 90 сут наблюдений. Данные по этим показателям показаны в таблице.
У интактных 12-мес животных контрольной группы МДА составлял 8,24 ± 1,69 нмоль/мг белка мозговой ткани, у 18-мес. статистически значимо МДА возрастал до уровня 8,56 ± 0,15, у 24-мес – до 9,03 ± 1,38 нмоль/мг белка ткани. Повышение МДА у крыс с 12-мес. возраста до 24-мес возраста составило 110 % (таблица).
После введения МНК во всех группах крыс, независимо от возраста, на всем периоде наблюдений наблюдали снижение уровня МДА в мозговой ткани на 30–48 %, более выраженное у молодых 12-мес. животных, по сравнению с контрольными данными (таблица).
После трансплантации МНК содержание ДК в гомогенате головного мозга опытных крыс увеличилось в среднем за весь период наблюдений на 15 % у 12-мес., на 2 % – у 18-мес. и 3 % – у 24-мес. крыс по отношению к контрольным данным. Такое увеличение ДК отражает тенденцию к накоплению продуктов перекисного окисления липидов в мозговой ткани крыс после введения МНК.
Следовательно, после трансплантации аллогенных МНК уровень МДА – конечного продукта липопероксидации – в мозговой ткани снижается во всех возрастных группах на протяжении всего периода наблюдений по сравнению с контролем, на фоне незначительного увеличения промежуточного продукта ДК.
Это отражает разную скорость генерации и расхода энергии в клетках, что по мере окислительной деградации, развивающейся как компенсаторно-адаптационная реакция на стресс – введение МНК, приводит к разбалансировке уровня конечного и промежуточного продуктов окисления. Большое значение при этом играет срок исследования последействия МНК. Вероятно, что 30 и 60 сут после введения МНК отражают процесс острой фазы пероксидации.
Для окончательного выявления состояния окислительной активности мозговой ткани после введения МНК определяли уровень оксида азота NOx в гомогенате мозга. Для этого использовали спектрофотометрический метод определения. Для построения калибровочной кривой использовали 1М водный раствор NaNO2. Количество нитрита рассчитывали в мкмолях/л по калибровочной кривой. Полученные результаты представлены в таблице.
Уровень малонового диальдегида (МДА), диеновых коньюгатов (ДК) и оксида азота (NOx) в гомогенате головного мозга крыс в разные сроки после введения МНК
|
Показатель |
Группа крыс по возрастам |
||
|
12 мес. |
18 мес. |
24 мес. |
|
|
контроль |
|||
|
МДА нмоль/мг белка |
8,24 ± 1,69 |
8,56 ± 0,15 |
9,03 ± 1,38 |
|
ДК нмоль/мг белка |
1,26 ± 0,26 |
1,44 ± 0,37 |
1,22 ± 0,12 |
|
NОx (мкМ) Мкмоль/л |
36,4 ± 0,41 |
42,6 ± 1,38 |
51,67 ± 0,34 |
|
через 30 сут |
|||
|
МДА нмоль/мг белка |
5,78 ± 0,09* |
6,11 ± 0,12* |
5,49 ± 0,17** |
|
ДК нмоль/мг белка |
1,52 ± 0,24* |
1,57 ± 0,43 |
1,28 ± 0,17** |
|
NОx (мкМ) Мкмоль/л |
46,5 ± 1,50* |
50,0 ± 2,18* |
56,3 ± 2,7** |
|
через 60 сут |
|||
|
МДА нмоль/мг белка |
4,28 ± 0,26** |
4,78 ± 0,12** |
4,98 ± 0,15** |
|
ДК нмоль/мг белка |
1,39 ± 0,07 |
1,54 ± 0,05 |
1,24 ± 0,006 |
|
NОx (мкМ) Мкмоль/л |
47,7 ± 1,45** |
53,3 ± 2,65** |
57,0 ± 1,16** |
|
через 90 сут |
|||
|
МДА нмоль/мг белка |
5,32 ± 0,20** |
5,84 ± 0,19** |
5,64 ± 0,09** |
|
ДК нмоль/мг белка |
1,28 ± 0,07 |
1,46 ± 0,13 |
1,24 ± 0,11** |
|
NОx (мкМ) Мкмоль/л |
47,3 ± 2,34** |
53,0 ± 1,21** |
53,2 ± 1,76** |
Примечание. * – p ≤ 0,01; ** – p ≤ 0,05 по сравнению с контрольными данными.
После трансплантации МНК исследования гомогената мозга показали увеличение содержания суммарных продуктов NOх, в среднем за весь период наблюдений – на 30 % у молодых крыс и 25 % – у зрелых животных, в то время как в мозговой ткани старых крыс уровень активности ПОЛ увеличился всего на 7–8 % по отношению к контрольным данным (таблица).Следует отметить, что старые 24–мес. животные изначально отличались повышенным уровнем продуктов NOх. После введения МНК наблюдали менее значимые изменения в накоплении суммарных продуктов оксида азота – превышение контрольных показателей составляло всего от 4 до 8 %.
Таким образом, введение МНК вызвало увеличение активности ПОЛ в мозговой ткани животных разных возрастных групп. На первом этапе исследования – 30 сут после введения МНК, повышение оксида азота в мозговой ткани животных сопровождалось повышенным уровнем диеновых конъюгатов, то есть промежуточного продукта окисления липидов. Через 60 дней после введения МНК была выявлена тенденция к снижению уровня ДК и суммарных продуктов NOх во всех возрастных категориях на фоне сниженных значений конечного продукта окислительных реакций в мозговой ткани – МДА, в сравнении с контрольными данными. Спустя 90 дней после введения МНК, во всех возрастных группах животных на фоне небольшого превышения (7–8 %) содержания NOх над контрольными данными, уровень ДК нормализовался, а уровень МДА оставался сниженным.
Выводы
На протяжении 60 сут после введения аллогенной мнонуклеарной фракции костного аспирата в мозговой ткани экспериментальных животных сохраняется высокий уровень перекисного окисления липидов. Только через 90 сут после введения МНК отмечается снижение активности ПОЛ в тканях мозга крыс.