Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,593

ANALYSIS OF COMPONENTS OF THE TOPICAL POWDER CONTAINING 5-NITROFURAL AND CYTOCHROME C FOR BURN WOUND TREATMENT

Korobko V.M. 1 Vorobyova O.A. 1 Melnikova N.B. 1
1 Nizhny Novgorod State Medical Academy
2090 KB
The control quality methods of the powder for treatment of burn wounds, which contain cytochrome c, nitrofural, sodium ascorbate and zinc oxide have been developed. UV – and HPLC – analsizes of 5 nitrofural and sodium ascorbate were carried out by dissolving the powder in acetonitrile:buffer solution of pH 6 (υ/υ 27:73), and then removing the precipitate. The identification of 5-nitrofural was performed by UV – spectroscopy using the band λ = 375 nm, comparing this spectrum with that aci-salt (λ = 450 nm). RP-HPLC analysis (identification and assay) of 5-nitrofural and sodium ascorbate was carried out at λ = 310 nm and 254 nm, Column Discovery C18 (250×4,6 mm, 5 μm) in isocratic mode at t = 35 °C. The identification of cytochrome c was performed after dissolving powder in water, analyzing the visible range (λ = 410–415, 520, 550 nm). Iron assay in cytochrome c was performed by AAS 7000 after dissolving the powder in the nitric acid using a hollow cathode lamp with λ = 248,33 nm, in a gaseous argon medium. Qualitative and quantitative analysis of zinc oxide was performed by AAS after dissolving of the powder in nitric acid (hollow cathode lamp λ = 213,9 nm in a gaseous medium air-acetylene, 2,2 l min-1). The methods validation of the assay using such characteristic as the reproducibility, linearity and convergence of all the active ingredients was spend.
analyses of powder
cytochrome c
nitrofural

Новым направлением в хирургии и ожоговой практике является вульнеросорбция, позволяющая удалять экссудат, микроорганизмы и их токсины из раны при помощи сорбционных материалов. Для заживления ожоговых и гнойных ран перспективна разработка адсорбентов, способных не только удалять экссудат и жидкость, но и дополнительно воздействовать на процессы воспаления и регенерации в ране. В этом плане большой интерес представляют собой наружные лекарственные средства (ЛС) в виде порошков, способные воздействовать на рану за счет улучшения микроциркуляции крови в зоне поражения.

Одним из перспективных вазодилатирующих ЛС является монооксид азота (в виде газа) или ЛС, способные образовывать нитрозильные комплексы, генерирующих монооксид азота. В настоящее время доказано, что монооксид азота не только улучшает микроциркуляцию крови, влияет на агрегацию тромбоцитов, но и играет важную роль в течение раневого процесса [1, 2].

Известно, что нитрозильные комплексы железа с серосодержащими лигандами являются депо монооксида азота [3–5]. Наиболее изучены в этом плане нитрозильные комплексы цитохрома с, имеющего железосодержащий порфириновый гем. Дизайн новых нитрозильных комплексов цитохрома с открывает возможности в создании ЛС с заданными биологическими свойствами для разработки современных стратегий в лечении раневых процессов.

Ранее нами было показано, что взаимодействие цитохрома с и нитросодержащих препаратов, таких как нитрит натрия, метронидазол, 5-нитрофурал, 5-нитроксолин, приводит к образованию нитрозильных комплексов цитохрома с, аналогичных нитрозильным комплексам, образованным цитохромом с и газообразным монооксидом азота [6]. На основании этих исследований была предложена комбинированная лекарственная форма «водный гель полисахарида + порошок (нитропрепарат, цитохром с», демонстрирующая в эксперименте на крысах высокие регенеративные и репаративные свойства и вазодилатирующий эффект [7].

В настоящей работе нами исследовано новое ЛС в виде порошка с цитохромом с, в котором в качестве донатора нитроксидной группы был выбран 5-нитрофурал из группы нитрофуранов, эффективных в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Роль стабилизатора и активатора восстановленной формы цитохрома с выполнял натрия аскорбат, дополнительным кератолитиком и антисептиком выступал цинк оксид, а в качестве основного сорбента был использован крахмал картофельный.

Целью работы является разработка методов качественного и количественного определения действующих веществ противоожогового порошка, содержащего цитохром с и 5-нитрофурал, как депо монооксида азота на ране, и валидационная оценка методов количественного определения по показателям правильность, воспроизводимость, линейность и сходимость действующих веществ.

Материалы и методы исследования

Реактивы: цитохром с (из сердца лошади) (≥ 95 %, lot STBB7839V, «Fluka» (USA) «Sigma-Aldrich»), нитрофурал (≥ 97 %, Product Number: 59870, «Aldrich» (USA) «Sigma-Aldrich»), натрия аскорбат (≥ 99 %, lot BCBJ1585V, «Fluka» (USA) «Sigma-Aldrich»), оксид цинка (ГОСТ 10262-73), крахмал (≥ 95 %, Product Number: 9005-25-8, «Fluka» (USA) «Sigma-Aldrich»), гидроксид натрия (ГОСТ 4328-77), кислота азотная («ХЧ», ГОСТ 4461-77), ацетонитрил для хроматографии сорт 0 (ТУ 2636-040-44493179-00), вода очищенная, полученная на установке «Elix-3» фирмы «MILLIPORE», удельное сопротивление менее 0,2 µСм.

Анализ электронных спектров был выполнен на UV-vis спектрофотометре Specord S100 Bioline (Analytic Jena, Германия), толщина кварцевой кюветы 10 мм.

ВЭЖХ-анализ 5-нитрофурала и натрия аскорбата проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе марки Shimadzu LC-10 Avp в обращенно-фазовом режиме, колонка Discovery C18 (250×4,6 mm, 5 μm) с диодно-матричным УФ-детектором. Условия хроматографирования: подвижная фаза ацетонитрил—фосфатный буфер 27:73 (ν/ν) в изократическом режиме при скорости потока 1 мл/мин при температуре 35 °C, объем инжекции 20 μL, детектирование при длинах волн 310 и 254 нм, время анализа 10 мин.

Элементный анализ выполняли на атомно-абсорбционном спектрофотометре (ААС) Shimadzu AA 7000. А). Количественное определение железа в цитохроме с проводили с использованием стандартных растворов Fe(NO3)3, лампы полого катода с λ = 248,33 нм, в газовой среде – аргон. Объем пробы – 20 μL. Б). Количественное определение цинка в оксиде цинка проводили непрерывно-пламенным методом, используя стандартные растворы Zn, лампу с полым катодом при λ = 213,9 нм в газовой среде воздух – ацетилен, 2,2 л∙мин-1. Объем пробы – 20 μL.

Стандартные растворы железа с концентрацией 2; 6; 10 мкг/л готовили из ГСО 7872-2000 Fe (10 мг/см3,фон – 1 М HNO3).

Стандартные растворы цинка с концентрацией 0,1; 0,2; 0,4 мг/л готовили из ГСО 7837-2000 Zn (10 мг/см3,фон – 1 М HNO3).

Приготовление модельных смесей 1,2,3: 0,25 г; 0,5 г; 0,75 г (точная навеска) 5-нитрофурала помещают в ступку, перетирают, добавляют 0,05 г цитохрома с, 0,1 г натрия аскорбата, 0,1 г цинка оксида до 100 г крахмала. Смесь перетирают пестиком до однородной желтоватой массы. 0,5 г (точная навеска) полученного порошка переносят в стакан на 50 мл, добавляют 15 мл подвижной фазы ацетонитрил-фосфатный буфер pH 6 в соотношении 27:73 (ν/ν), растворяют, фильтруют через фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 25 мл. Раствор в мерной колбе доводят до метки раствором подвижной фазы (соответствует 50 %, 100 %, 150 % ожидаемой концентрации испытуемого раствора).

Приготовление модельных смесей 4,5,6 выполняют аналогично процедуре приготовления модельных смесей 1,2,3, используя 0,05 г; 0,1 г; 0,15 г (точной навески) натрия аскорбата. Состав смеси: 0,05 г цитохрома с, 0,5 г нитрофурала, 0,1 г цинка оксида и натрия аскорбата, крахмала до 100 г. После растворения порошка в 25 мл раствора подвижной фазы, концентрация натрия аскорбата в испытуемом растворе соответствовала 50 %, 100 %, 150 % от ожидаемой.

Стандартные растворы натрия аскорбата (0,02 мг/мл), 5-нитрофурала (0,1 мг/мл) готовили из стандартных образцов субстанций.

Статистическую обработку проводили по программе Statistica 7.0 (р < 0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Общая схема пробоподготовки для анализа всех действующих веществ представлена ниже:

Методика качественного и количественного определения 5-нитрофурала и натрия аскорбата в порошке.

Идентификацию 5-нитрофурала проводили, используя визуальный тест (переход из желтой в оранжевый цвет аци-соли после добавления 30 % гидроксида натрия) и УФ – спектроскопически, анализируя полученный водно-ацетонитрильный раствор (λ = 375 нм) и, сопоставляя этот спектр со спектром аци-соли (появление плеча λ = 450 нм) (рис. 2).

kor1.wmf

Рис. 1. Общая схема пробоподготовки для анализа действующих веществ порошка

kor2a.wmf kor2b.wmf

а) б)

Рис. 2. УФ-спектры ацетонитрильно-буферного раствора смеси 5-нитрофурала и натрия аскорбата после растворения порошка и удаления осадка: 2 а) исходный раствор; 2 б) после добавления 30 % гидроксида натрия

Натрия аскорбат доказывали тестом с аммиачным раствором серебра по образованию черного осадка серебра.

Два компонента 5-нирофурал и натрия аскорбат анализировали ОФ ВЭЖХ методом после растворения порошка в смеси ацетонитрил:фосфатный буферный раствор pH 6 при объемном соотношении 27:73 и удаления нерастворимого осадка, содержащего цитохром с, оксид цинка и крахмал (рис. 1).

Время выхода пика 5-нитрофурала – 4,8 мин, натрия аскорбата – 2,9 мин на хроматограммах растворов модельных смесей совпадало со временем выхода этих соединений в стандартных растворов в изократическом режиме при t = 35 °C (рис. 3).

Определение линейности проводили на 3 уровнях концентраций для 5-NO2 F и для NaAsc от ожидаемых содержаний в порошке. Уравнения линейной регрессии имеют вид: у = 1.980504e + 007 (5-NO2 F) и у = 4.720793e + 007 (NaAsc). Значения коэффициента корреляции для обоих веществ было равным 0,99, что соответствует критерию приемлемости по показателю линейности [8].

kor3a.wmf

а)

kor3b.wmf

б)

Y = aX + b

a = 1.980504e+007

b = 0.0

R2 = 0.9993153

r = 0.9996576

Внешний стандарт

Средний RF: 2.001672e+007

RF СО: 331384.0

RF %СКО: 1.655536

Уровень

Концентрация, мг/мл

Средняя площадь

Площадь 1

Площадь 2

Площадь 3

1

0,05

1013907

1013676

1011798

1016247

2

0,1

2019115

2014528

2020407

2022411

3

0,15

2937130

2945730

2933428

2932232

kor3c.wmf

в)

kor3d.wmf

д)

Y = aX + b

a = 4.720793e+007

b = 0.0

R2 = 0.9999995

r = 0.9999998

Внешний стандарт

Средний RF: 4.744187e + 007

RF СО: 1613611

RF %СКО: 3.401240

Уровень

Концентрация, мг/мл

Средняя площадь

Площадь 1

Площадь 2

Площадь 3

1

0,01

483528

335186

510289

456766

2

0,022

1038955

1049700

1043742

1023422

3

0,028

1317435

1304687

1338484

1309134

Рис. 3 а, б, в, д. Хроматограммы модельных смесей, содержащих 5-NO2F и NaAsc, и калибровочные графики действующих веществ: 3 а) – модельной смеси 2, содержащей 0,1 мг/мл 5-NO2F при постоянстве концентраций остальных действующих веществ; 3 б) – калибровочный график по 5-NO2F; 3 в) – модельной смеси 5, содержащей 0,02 мг/мл NaAsc при постоянстве концентраций остальных действующих веществ; 3 д) – калибровочный график по NaAsc. Условия: λ = 310 и 254 нм, объем пробы 20 μL, ν потока 1мл/мин, t = 35 °C

Таблица 1

Результаты количественного определения 5-нитрофурала по методу «введено-найдено»

Введено, г

Найдено, г

Выход, %

Метрологические характеристики

0,25

0,24

96

Хср = 100,7

SD = 5,15

RSD = 0,51 %

Е = 4,21 %

0,25

0,27

108

0,25

0,26

106

0,5

0,49

98

0,5

0,48

96

0,5

0,52

104

0,75

0,77

102

0,75

0,72

96

0,75

0,76

101

Таблица 2

Результаты количественного определения натрия аскорбата по методу «введено-найдено»

Введено, г

Найдено, г

Выход, %

Метрологические характеристики

0,05

0,049

98

Хср = 100,1

SD = 9,48

RSD = 0,94 %

Е = 7,44 %

0,05

0,051

102

0,05

0,048

96

0,1

0,09

90

0,1

0,11

110

0,1

0,12

120

0,15

0,14

93

0,15

0,16

106

0,15

0,13

86

kor4.wmf

Рис. 4. Электронный спектр cyt c раствора в присутствии натрия аскорбата

kor5.tif

Рис. 5. Зависимость поглощения от концентрации железа

Правильность методики определяли методом «введено-найдено». Отношение количества введенного 5-нитрофурала к найденному (Хср) в % соответствовало 100,7 %, что характеризует разработанную методику как правильную (табл. 1). Величина Хср для NaAsc, рассчитанная по этому методу соответствовала 100,1 %, что определяет правильность методики определения двух компонентов в одной пробе (табл. 2).

Методика удовлетворяет требования по сходимости для обоих анализируемых компонентов – 5-NO2F и NaAsc, о чем свидетельствуют критерии приемлемости RSD % = 0,51 % и RSD % = 0,94 %, соответственно.

Анализ цитохрома с. Идентификацию сyt c в порошке проводили после его растворения в воде и удаления нерастворимого осадка, анализируя видимую область спектра (λ = 410–415, 520, 550 нм).

Количественное определение проводили методом ААС после растворения его в концентрированной азотной кислоте, используя лампу полого катода с λ = 248,33 нм, в газовой среде – аргон. Результаты с использованием калибровочного графика (уравнение Abs = y = 0.0284 CFe-0.0507, где [СFe] = мкг/л) представлены на рис. 5 и в табл. 3.

Как следует из данных табл. 3, значения относительного стандартного отклонения RSD и стандартного отклонения SD малы и составляют 5,5 % и 0,025 %. В соответствии с требованиями руководства [8] эту методику можно считать правильной и воспроизводимой.

Анализ оксида цинка в порошке. Качественный и количественный анализ цинка оксида в порошке проводили методом ААС после растворения его в азотной кислоте, используя лампу полого катода λ = 213,9 нм в газовой среде воздух – ацетилен, 2,2 л∙мин-1. Процедура выполнения пробоподготовки и анализа в целом аналогична анализу железа в цитохроме с. Калибровочный график (уравнение Abs = y = 0.4829СZn – 0,0018, где [СZn] = мг/л приведен на рис. 6.

kor6.tif

Рис. 6. Зависимость поглощения от концентрации цинка (ААС)

Таблица 3

Результаты анализа железа методом ААС

Действие

Истинное значение концентрации (мкг/л)

Концентрация (мкг/л)

Абсорбция

RSD, %

SD

STD-1

2,000

1,7401

0,0013

6,12

0,023

STD-2

2,000

2,2892

0,0143

STD-3

2,000

1,8774

0,0026

STD-AV

2,000

1,9689

0,0052

STD-1

6,000

5,4533

0,1042

4,14

0,025

STD-2

6,000

3,6161

0,0520

STD-3

6,000

6,6711

0,1388

STD-AV

6,000

6,0622

0,1215

STD-1

10,000

9,2720

0,2127

5,58

0,027

STD-2

10,000

9,5888

0,2217

STD-3

10,000

11,0494

0,2632

STD-AV

10,000

9,9689

0,2325

Cyt с

4,4803

0,1271

6,06

0,024

Cyt с

4,4921

0,1123

Cyt с

4,4823

0,1040

Примечание. * аббревиатура STD относится к стандартам, прилагаемым к прибору.

Таблица 4

Результаты анализа цинка методом ААС

Действие

Истинное значение концентрации (мг/л)

Концентрация (мг/л)

Абсорбция

RSD, %

SD

1

2

3

4

5

6

STD-1

0,100

0,0886

0,0410

1,20

0,005

STD-2

0,100

0,0901

0,0417

STD-3

0,100

0,0885

0,0409

STD-AV

0,100

0,0895

0,0414

STD-1

0,200

0,2092

0,0992

4,35

0,0045

STD-2

0,200

0,2222

0,1055

STD-3

0,200

0,2221

0,1054

STD-AV

0,200

0,2158

0,1024

STD-1

0,400

0,3829

0,1831

4,23

0,0080

STD-2

0,400

0,4063

0,1944

STD-3

0,400

0,3820

0,1829

STD-AV

0,400

0,3947

0,1888

Zn

0,3875

0,1853

3,17

0,0060

Zn

0,4051

0,1938

Zn

0,3964

0,1896

Примечание. * аббревиатура STD относится к стандартам, прилагаемым к прибору.

Как следует из данных табл. 4 значений относительного стандартного отклонения RSD и стандартного отклонения SD, составляющих 3,2 % и 0,006 %, методику определения цинка в порошке можно считать правильной и воспроизводимой.

Выводы

1. Разработана методика УФ – спектрального и ВЭЖ- хроматографического анализов 5-нитрофурала и натрия аскорбата. Рекомендовано:

1) пробоподготовку для анализа проводить растворением порошка в смеси ацетонитрил:фосфатный буферный раствор pH 6 в объемном соотношении 27:73 и удалением нерастворимого осадка цитохрома с, оксида цинка и крахмала фильтрацией.

2) идентификацию 5-нитрофурала выполнять УФ – спектроскопически, анализируя полученный водно-ацетонитрильный раствор (λ = 310 нм) и, сопоставляя этот спектр со спектром аци-соли, полученной добавлением 30 % гидроксида натрия (λ = 420 нм).

3) ОФ ВЭЖХ анализ (идентификацию и количественное определение) 5-нитрофурала и натрия аскорбата проводить при λ = 310 нм на колонке Discovery C18 (250×4,6 mm, 5 μm) в изократическом режиме при t = 35 °C c использованием стандартных растворов. Время выхода пика 5-нитрофурала – 4,8 мин, натрия аскорбата – 2,9 мин.

2. Разработана методика анализа цитохрома с в порошке. Рекомендовано:

а) идентификацию проводить после его растворения порошка в воде, анализируя видимый область спектра (λ = 410–415, 520, 550 нм);

б) количественное определение выполнять методом ААС после растворения его в концентрированной азотной кислоте, используя лампу полного катода с λ = 248,33 нм, в газовой среде – аргон.

3. Разработана методика качественного и количественного анализа цинка оксида в порошке методом ААС в соответствии с которой после растворения его в азотной кислоте, выполнять анализ используя лампу полного катода λ = 213,9 нм в газовой среде воздух – ацетилен, 2,2 л мин –1.

4. Проведена валидационная оценка методов количественного определения по показателям правильность, воспроизводимость, линейность и сходимость 5-нитрофурала, натрия аскорбата, цитохрома с, цинка оксида в порошке.