Медико-социальная значимость борьбы с анкилозирующим спондилоартритом (АС) обусловлена его достаточно высокой распространенностью (от 0,5% до 2%), заболеваемостью в социально активном возрасте, неуклонным прогрессированием заболевания с анкилозированием позвоночника и крупных суставов, значительным ухудшением качества жизни, длительной потерей трудоспособности, высокой инвалидизацией. Трудности борьбы с этим заболеванием связаны с неясностью этиопатогенетических механизмов и вследствие этого недостаточной эффективностью используемых лекарственных средств. Доказанная связь АС с антигеном HLA-В27 предполагает генетическую предрасположенность этого заболевания, но остается неясным – почему у некоторых здоровых людей носителей этого антигена заболевание не развивается, а у некоторых людей с отсутствием HLA-В27 болезнь развивается. Учитывая, что генетическая предрасположенность к заболеваниям реализуется через метаболизм нуклеиновых кислот, мы в своей работе провели исследования активности 7 ферментов предшественников нуклеиновых кислот – пуриновых метаболитов: аденозиндезаминазы (АДА), АМФ-дезаминазы (АМФДА), адениндезаминазы (АД), гуаниндезаминазы (ГДА), гуанозиндезамназы (ГЗДА), пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ) и гуанозинфосфорилазы (ГФ) в иммунокомпетентных клетках крови – лимфоцитах больных АС в условиях стационарного лечения. В своих ранних исследованиях мы изучали активность ферментов отдельно по адениловой и гуаниловой ветви ПМ в плазме крови и эритроцитах больных АС [2, 3].
Цель исследования. Выявить особенности активности АДА, АМФДА, АД, ГДА, ГЗДА, ПНФ и ГФ в лизатах лимфоцитов больных АС в зависимости от клинических проявлений заболевания для повышения качества диагностики и возможного участия ферментов пуринового метаболизма (ПМ) в патогенетических механизмах АС.
Материал и методы исследований
Под наблюдением находились 56 больных АС, из которых 50 (89,3%) мужчин и 6 (10,7%) женщин. Средний возраст больных (M±m) – 36,9±1,3 лет, длительность болезни – 6,6±0,4 лет. Диагноз АС устанавливался на основании модифицированных Нью-Йоркских критериев [10]. Степень активности патологического процесса определялась в соответствии с рекомендациями Европейской лиги ревматологов и индекса БАСДАЙ [8]. Стадия поражения суставов и позвоночника устанавливалась на основании рентгенологических данных и индекса БАСРИ [9]. Функциональная недостаточность суставов и позвоночника определялась с учетом индекса БАСФИ [7]. I степень активности процесса установлена у 16 (28,6%), II степень – у 30 (53,6%) и III степень – у 10 (17,8%) больных. I стадия поражения суставов и позвоночника определялась у 6 (10,7%), II стадия – у 24 (42,9%), III стадия – у 20 (35,7%) и IV стадия – у 6 (10,7%) больных. Функциональная недостаточность суставов 0 степени (ФНС-0) установлена у 4 (7,1%), ФНС-1 – у 15 (26,8%), ФНС-2 – у 31 (55,4%) и ФНС-3 – у 6 (10,7%) больных. Быстропрогрессирующее течение (БПТ) выявлено у 15 (26,8%), медленнопрогрессирующее течение (МПТ) – у 41 (73,2%) больного. По данным рентгенологических исследований наиболее часто поражались крестцовоподвздошные сочленения (100%), поясничный отдел позвоночника (85,7%), грудной отдел (66,1%), лонные сочленения (32%). Клинические проявления энтезопатий выявлены в 55,4% случаев, поражения сердечно-сосудистой системы – в 28,6%, патология почек – в 19,6% случаев. Комплексная терапия больных включала нестероидные противовоспалительные препараты, инфликсимаб, сульфасалазин, глюкокортикоиды (локально), лечебную физкультуру, массаж. Дозы и виды лечебных препаратов назначались в зависимости от тяжести заболевания. Контрольную группу составили 35 практически здоровых людей.
Выделение лимфоцитов из венозной крови проводили по методике Boyum [6] с использованием лимфосепа с плотностью 1,077-1,079 г/мл. Лизаты лимфоцитов готовили путем трехкратного замораживания-оттаивания и центрифугирования. Активность ферментов определяли по оригинальным методикам, описанным в работах Н.М. Девятаевой [1] и Е.В. Кукушкиной [5] и выражали в нмоль/мин на 1 мл., содержащий 1×107 клеток (до лизиса). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы «STATISTICA 6.0» с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m), стандартного отклонения средней (σ). Достоверность различий считалась при р <0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
По сравнению со здоровыми, у больных АС (всей группы) в лизатах лимфоцитов (табл. 1) выше активность АМФДА, АД, ГДА, ГЗДА, ПНФ, ниже активность АДА и ГФ (все р˂0,001). Через 7-8дней лечения (табл. 1) снизилась активность АД (р˂0,001), АМФДА (р˂0,01), повысилась ранее сниженная активность АДА (р˂0,01), незначительно снизилась активность ГДА, ГЗДА, ПНФ и повысилась активность ГФ (все р˃0,05). По окончании курса стационарного лечения по сравнению с начальным этапом (таблица), отмечалась положительная динамика индексов БАСДАЙ и БАСФИ (р˂0,001), симптомов Отто и Шобера (р˂0,001), Форестье (р˂0,05), Томайера (р=0,063). В лимфоцитах снизилась активность АМФДА, АД, ГДА, ГЗДА, ПНФ, повысилась ранее сниженная активность АДА и ГФ (р˂0,001). Перед выпиской не имели отличий от здоровых показатели активности АД, ПНФ, ГФ (все р˃0,05), но осталась повышенной активность ГДА и ГЗДА (р˂0,001), АМФДА (все р˂0,01) и сниженной активность АДА (р˂0,01).
Учитывая возможное влияние клинических особенностей АС на энзимную активность, были проведены соответствующие исследования. Так, у больных АС с БПТ по сравнению с больными МПТ в лимфоцитах (табл. 1) выше активность АМФДА, АД, ГЗДА (все р˂0,001), ниже активность АДА (р=0,0003), ГФ (р=0,048), незначительно выше активность ГДА (р=0,202) и ниже ПНФ (р=0,198).
У больных с I стадией поражения суставов и позвоночника (таблица) по сравнению с больными с II стадией в лимфоцитах выше активность АДА (р=0,038), ниже активность АД (р=0,0003), АМФДА (р=0,035), незначительно ниже активность ГДА (р=0,066), ГЗДА (р=0,051), ПНФ (р=0,087), выше ГФ (р=0,068); по сравнению с больными с III стадией выше активность АДА (р=0,0004), ГФ (р=0,027), ниже активность АМФДА (р=0,0003), АД (р=0,0002), ГЗДА (р=0,0008), незначительно ниже активность ГДА (р=0,059) и ПНФ (р=0,086); по сравнению с больными с IV стадией, выше активность АДА (р=0,0003), ГФ (р=0,0005), ниже активность АМФДА и АД (все р˂0,001), ГЗДА (р=0,0004), незначительно ниже активность ГДА (р=0,132) и выше ПНФ (р=0,462). У больных с II стадией (табл. 1) по сравнению с больными с III стадией выше активность АДА (р=0,0003), ГФ (р=0,047), ниже активность АМФДА (р=0,0001), АД (р=0,0002), ГЗДА (р=0,042), незначительно ниже активность ГДА (р=0,052) и ПНФ (р=0,094); по сравнению с больными с IV стадией выше активность АДА (р=0,0004), ГФ (р=0,0024), ниже активность АМФДА (р=0,0002), АД (р=0,0003), ГЗДА (р=0,0005), незначительно ниже активность ГДА (р=0,316) и выше ПНФ (р=0,112). У больных с III стадией (табл. 1) по сравнению с больными с IV стадией ниже активность АМФДА (р=0,043), АД (р=0,045), ГЗДА (р=0,048), незначительно выше активность АДА (р=0,055), ГДА (р=0,251) и ПНФ (р=0,143).
Активность ферментов (нмоль/мин/мл) в лизатах лимфоцитов здоровых и больных АС
|
Контингент |
Кол-во б-ных |
Стат. пок-ли |
АДА |
АМФДА |
АД |
ГДА |
ГЗДА |
ПНФ |
ГФ |
|
Здоровые |
35 |
M σ m |
45,8 3,94 0,67 |
3,18 0,32 0,05 |
1,94 0,24 0,04 |
11,3 0,53 0,09 |
7,61 0,66 0,11 |
35,1 2,96 0,50 |
11,4 0,35 0,23 |
|
Больные АС, вся группа, поступление |
56 |
M σ m |
37,8 4,18 0,56 |
3,73 0,28 0,04 |
2,33 0,22 0,03 |
14,3 3,07 0,41 |
10,2 3,09 0,41 |
41,8 7,16 0,96 |
9,57 2,43 0,32 |
|
Больные АС, вся группа, через 7-8 дней лечения |
56 |
M σ m |
39,8 3,02 0,40 |
3,58 0,20 0,03 |
2,20 0,16 0,02 |
13,4 2,23 0,30 |
9,60 2,22 0,30 |
39,7 5,38 0,72 |
10,0 1,76 0,24 |
|
Больные АС, вся группа, по окончании лечения |
56 |
M σ m |
44,0 1,24 0,17 |
3,29 0,08 0,01 |
1,98 0,05 0,01 |
12,0 0,66 0,09 |
8,34 0,80 0,11 |
35,7 1,29 0,17 |
11,2 0,33 0,04 |
|
Больные АС, БПТ |
15 |
M σ m |
34,7 2,71 0,70 |
4,01 0,20 0,05 |
2,54 0,14 0,04 |
14,8 4,35 1,12 |
12,5 3,52 0,91 |
40,7 10,6 2,74 |
8,47 2,34 0,61 |
|
Больные АС, МПТ |
41 |
M σ m |
38,9 4,13 0,64 |
3,63 0,24 0,04 |
2,25 0,19 0,03 |
14,2 2,34 0,37 |
9,42 2,49 0,39 |
42,2 5,53 0,86 |
9,97 2,36 0,37 |
|
Больные АС, стадия I |
6 |
M σ m |
43,5 2,88 1,17 |
3,37 0,14 0,06 |
1,98 0,06 0,03 |
12,8 1,42 0,58 |
7,27 1,26 0,51 |
39,8 2,54 1,04 |
11,6 1,67 0,68 |
|
Больные АС, стадия II |
24 |
M σ m |
39,3 3,66 0,75 |
3,58 0,18 0,04 |
2,23 0,13 0,03 |
13,8 1,84 0,37 |
9,2 2,18 0,45 |
41,9 4,88 1,00 |
10,3 2,41 0,49 |
|
Больные АС, стадия III |
20 |
M σ m |
35,5 2,75 0,61 |
3,92 0,18 0,04 |
2,47 0,14 0,03 |
15,3 3,36 0,75 |
11,2 2,9 0,65 |
43,4 7,55 1,69 |
8,81 2,27 0,51 |
|
Больные АС, стадия IV |
6 |
M σ m |
33,5 0,69 0,28 |
4,11 0,07 0,03 |
2,60 0,07 0,03 |
14,1 5,97 2,44 |
14,2 3,33 1,36 |
38,6 14,3 5,83 |
7,28 0,44 0,18 |
|
Больные АС, I степень активности |
16 |
M σ m |
43,5 1,54 0,39 |
3,39 0,12 0,03 |
2,08 0,12 0,03 |
12,5 0,52 0,13 |
7,13 0,53 0,13 |
40,0 1,31 0,33 |
13,2 0,53 0,13 |
|
Больные АС, II степень активности |
30 |
M σ m |
36,4 1,87 0,34 |
3,83 0,20 0,04 |
2,39 0,17 0,03 |
16,7 1,55 0,28 |
10,0 0,76 0,14 |
47,1 2,61 0,48 |
8,42 0,55 0,10 |
|
Больные АС, III степень активности |
10 |
M σ m |
32,9 0,39 0,12 |
3,98 0,19 0,06 |
2,53 0,12 0,04 |
9,78 0,97 0,31 |
16,0 1,50 0,48 |
29,0 2,59 0,82 |
7,18 0,27 0,08 |
Деструкция суставов, позвоночника, околосуставных тканей, как правило, являются последствиями иммуно-воспалительного и дистрофического процессов, и их выраженность и длительность определяют степень деструкции или стадии поражения. Исходя из этого, нами были проведены исследования активности ферментов в зависимости от степени активности патологического процесса. Так, у больных с I степенью по сравнению со здоровыми (таблица) в лимфоцитах выше активность АМФДА (р=0,0084), АД (р=0,0473), ГДА (р=0,0006), ГЗДА (р=0,0007), ПНФ (р=0,0006), ниже активность АДА (р=0,0462) и ГФ (р=0,0008).
Если же учитывать индивидуальные энзимные показатели, а не среднестатистические величины активности энзимов, то за пределы условной (нормы, рассчитанной по формуле М±2σ, в лимфоцитах выходили только показатели ГДА в 56,3% случаев и ПНФ – в 31,3% случаев. У этих же больных за пределы нормы выходили показатели СОЭ, СРБ и сиаловых кислот в 37,5%, 37,5% и 25% случаев, соответственно. То есть, показатели ПНФ оказались более информативными в отражении минимальной активности процесса, чем общепринятые острофазовые показатели.
За период стационарного лечения нормализовалась активность АДА, АМФДА, АД, ПНФ, ГФ и только активность ГДА (р=0,0006) и ГЗДА (р=0,0007) осталась повышенной.
По сравнению со здоровыми у больных АС с II степенью (табл. 1) в лимфоцитах выше активность АМФДА, АД, ГДА, ГЗДА, ПНФ, ниже АДА и ГФ (все р˂0,001), у больных АС с III степенью выше активность АМФДА, АД, ГЗДА, ниже активность АДА, ГДА, ПНФ и ГФ (все р˂0,001).
После проведенного курса стационарного лечения у больных с II степенью нормализовались активности АД и ГФ, но активность АДА осталась ниже, чем у здоровых (р˂0,01), а активности АМФДА (р˂0,05), ГДА и ГЗДА (р˂0,001), ПНФ (р˂0,01) остались выше, чем у здоровых; у больных АС с III степенью нормализовались активности АМФДА, АД, ПНФ, ГФ, но остались ниже активности АДА и ГДА (р˂0,05) и выше ГЗДА (все р˂0,0001).
Сравнительные исследования показали, что у больных АС с I степенью по сравнению с больными с II степенью, в лимфоцитах выше активность АДА и ГФ (р˂0,0001), ниже активность АМФДА, АД, ГДА, ГЗДА и ПНФ (все р˂0,001); по сравнению с больными с III степенью выше активность АДА, ГФ, ГДА, ПНФ, ниже АМФДА, АД и ГЗДА (все р˂0,001).
У больных с II степенью по сравнению с больными с III степенью, выше активность АДА, ГДА, ПНФ, ГФ (все р˂0,001), ниже активность АД (р=0,0425), ГЗДА (все р˂0,0001), незначительно ниже активность АМФДА (р=0,0542).
Анализ энзимных показателей в зависимости от клинических проявлений АС выявил некоторые закономерности изменений активности ферментов. Так, чем острее течение заболевания, тем в лимфоцитах выше активность АМФДА, АД, ГДА, ГЗДА, ниже АДА, ПНФ и ГФ. Чем больше стадия поражения суставов и позвоночника, тем ниже активность АДА, ГФ, выше АМФДА, АД, ГДА, ГЗДА. Чем выше активность процесса, тем в лимфоцитах выше активность АМФДА, АД, ГЗДА, ниже активность АДА, ПНФ и ГФ. Одной из особенностей активности ферментов в лимфоцитах больных АС с высокой (II-III) степенью активности патологического процесса является сниженная активность АДА и ПНФ. Если рассматривать этот феномен с биохимических позиций и учитывать, что аденозин и гуанозин являются естественными субстратами АДА и ПНФ, то логично предположить, что при дефиците этих ферментов в лимфоцитах будет происходить накопление этих субстратов. Сниженные активности АДА и ПНФ не могут быть объяснены низким содержанием их субстратов, так как при исследовании активности этих ферментов in vitro были использованы оптимальные концентрации субстратов. Повышенное содержание аденозина и гуанозина в лимфоцитах, по данным литературы, может существенно нарушить процессы созревания, дифференциации, пролиферации лимфоцитов, стимулировать аденилатциклазу, что влечет накопление циклического аденозинмонофосфата и повышенную выработку фактора некроза опухоли–альфа [4]. То есть, избыточное содержание аденозина и гуанозина в лимфоцитах больных АС при дефиците АДА и ПНФ может существенно нарушить иммунорегуляторные процессы и составить отдельные звенья патогенеза АС.
Выводы
1. У больных АС по сравнению со здоровыми в лизатах лимфоцитов выше активность АМФДА, АД, ГДА, ГЗДА, ПНФ, ниже активность АДА и ГФ.
2. Между стадиями поражения суставов и позвоночника, вариантами течения и степенями активности процесса выявлены статистически значимые энзимные различия, способствующие их дифференциации.
3. Чем острее течение заболевания, больше стадия поражения, выше степень активности процесса, тем в лимфоцитах выше активность АМФДА, АД, ГЗДА, ниже активность АДА, ПНФ и ГФ.
4. Исследования активности ферментов в лимфоцитах больных АС в процессе лечения способствуют объективизации оценки эффективности назначенной терапии.
5. Дефицит активности АДА и ПНФ в лимфоцитах при высоком содержании аденозина и гуанозина у больных АС может обусловить нарушения иммунорегуляторных процессов и составить отдельные звенья патогенеза АС.