Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,578

THE EFFECT OF BIOACTIVE OSTEO-GENERATING COATINGS ON METAL IMPLANTS ON FUNCTIONAL ACTIVITY OF INNATE IMMUNITY CELLS

Kuznetsova T.A. 1 Zaporozhets T.S. 1 Smolina T.P. 1 Besednova N.N. 1 Puz A.V. 2 Sinebryuhov S.L. 2 Gnedenkov S.V. 2
1 G.P. Somov Research Institute of Epidemiology and Microbiology
2 Institute of Chemistry FEB RAS
The influence of bioactive calcium phosphate coatings formed on commercially pure titanium BT1-0 using the technology of plasma electrolytic oxidation (PEO) on the function of innate immunity cells were studied. It was found that the functional activity of human peripheral blood polymorphonuclear leukocytes (NF) depend on the processing method of coatings. As a result, the significant changes in the functional state of the NF were registered when cells were incubated with the sample of commercially pure titanium and with the sample of coating formed on the titanium by PEO. The cells reaction expressed in enhancing density of activation molecules CD69, CD38, CD11b on the membranes with CD62L shedding and in increasing of phagocytic and bactericidal activity. HF activity did not differ compared to control when cells were incubated with composite PEO-coating with superdispersed polytetrafluoroethylene. These findings indicate on the absence of reaction of innate immunity cells and, consequently, on the best biocompatibility of this coating.
implants
coatings
hydroxyapatite
biocompatibility
innate immunity
neutrophils
activation markers
phagocytic and bactericidal activity

В современной медицине широко используются искусственные материалы (имплантаты) для замены поврежденной костной ткани. Введение имплантата в организм всегда связано с риском микробного инфицирования. Инфекционные осложнения, источниками которых могут быть микроорганизмы, присутствующие в операционных, хирургический персонал, оборудование, резидентная микрофлора на коже пациента, очаги хронических инфекций внутри его организма, являются серьезной проблемой в ортопедии. Они требуют необходимости замены имплантата, а в тяжелых случаях, могут стать причиной ампутации конечности и смерти больного. В основе нежелательного влияния имплантационных материалов лежит каскад событий, проявляющихся в активации иммунокомпетентных клеток, усилении продукции цитокинов и протеолитических ферментов и др., характерных для воспалительной реакции и приводящих к развитию патологического состояния [6].

С учетом этого, имплантационные материалы должны соответствовать ряду требований: структурной и поверхностной совместимостью с тканями организма, способностью к биодеградации, свойствами по обеспечению диффузии питательных веществ и удалению продуктов жизнедеятельности клеток, антикоррозийностью, но прежде всего они должны быть нетоксичными и биологически инертными [4, 6]. К числу материалов, широко используемых в имплантационной хирургии относятся титан и его сплавы [1, 2].

С целью повышения прочности имплантационных материалов, улучшения процессов остеоинтеграции и предотвращения нежелательных реакций, на имплантат наносят покрытия, состоящие из родственных организму материалов. К таким покрытиям относятся соединения на основе фосфатов кальция (гидроксиапатиты), физические и химические свойства которых обеспечивают биосовместимость, стимуляцию остеогенеза и восстановление костной ткани [2, 4]. Для нанесения покрытий используют такие методы, как золь-гель технология, анодирование, электроосаждение, плазменное напыление, плазменное электролитическое оксидирование (ПЭО) и др. Метод ПЭО позволяет формировать на поверхности изделий слои, включающие в свой состав как элементы матрицы (оксидируемого металла), так и элементы электролита [2].

Ранее нами установлено, что пористая поверхность кальциево-фосфатных покрытий, сформированных на поверхности имплантатов методом ПЭО, по минеральному составу и механическим характеристикам приближается к характеристикам костной ткани и обеспечивает стимуляцию остеогенеза [1]. В то же время безопасность, биосовместимость и функциональность покрытий зависят от реакции иммунной системы на имплантат [6]. В этой связи актуален поиск имплантационных материалов, отвечающих предъявляемым к ним требованиям, в частности препятствующих развитию воспалительной реакции и патологического состояния. Понимание сложных взаимодействий организма человека и имплантатов вызывает необходимость исследования реакции иммунной системы и в первую очередь нейтрофильных лейкоцитов (Нф) как основных эффекторных клеток врожденного иммунитета.

Целью работы явилось изучение влияния биоактивных кальций-фосфатных покрытий, формируемых на технически чистом титане ВТ1-0 с использованием технологии ПЭО, на функциональную активность Нф периферической крови человека.

Материалы и методы исследования

В качестве материала для нанесения покрытия использовался технически чистый титан марки ВТ1-0 (Fe 0,25 %; Si 0,12 %; С 0,07 %; О 0,12 %; N 0,04 %; Н 0,01 %, остальное Ti). Перед оксидированием образцы покрытий в виде дисков с площадью поверхности 49 мм2 и толщиной 1 мм обрабатывали механическим способом, освобождая поверхность от различных дефектов, промывали в дистиллированной воде и обезжиривали спиртом (образец 1). Плазменное электролитическое оксидирование проводили в биполярном режиме [1, 2] в электролите, содержащем 30 г/л глицерофосфата кальция (C3H7O6P)Ca·2H2O и 40 г/л ацетата кальция Ca(CH3COOO)2·H2O (образец 2). Согласно данным рентгенофазового анализа, в состав покрытия входит гидроксиапатит Ca10(PO4)6(OH)2. Для запечатывания пор ПЭО-слоя и создания композиционного полимерсодежащего покрытия использовали ультрадисперсный политетрафторэтилен (УПТФЭ, торговая марка Форум®), полученный методом термоградиентного синтеза (метод разработан в лаборатории фторидных материалов Института химии ДВО РАН). Нанесение полимера на ПЭО-покрытие осуществляли двумя способами. При использовании 1-го образцы на 15 секунд погружали в суспензию на основе изопропилового спирта, содержащую частицы УПТФЭ размером 0,2–0,6 мкм (100–150 г/л) и смачиватель ОП-10 (6,0–8,0 г/л). После полного испарения изопропилового спирта с поверхности, образец подвергали термической обработке при 200–250 °С в течение 3 минут (образец 3). При 2-ом способе нанесение полимера осуществляли электрофоретическим методом с последующей термообработкой композиционного покрытия в муфельной печи при 315 °С в течение 15 минут (образец 4). Концентрация частиц в используемой суспензии составляла 20 г/л. Напряжение электрофоретического осаждения частиц полимера на ПЭО-слой поддерживалось потенциостатически при значении 200 В.

Стерилизацию образцов осуществляли в 70 % этаноле в течение 30 минут, а затем в ламинаре под лампой УФО по 20 мин с каждой стороны образца.

Влияние покрытий на экспрессию поверхностных маркеров Нф осуществляли с использованием культуры лейкоцитов периферической крови здоровых доноров. Кровь разводили 1:2 полной питательной средой RPMI-1640, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 0,01 М HEPES, 200 мМ L-глутамина, 100мг/мл гентамицина, и вносили в стерильные пластиковые 24-луночные планшеты («CellStar») с образцами покрытий, инкубировали при 37°С в течение 20 час с 5 % СО2, затем кровь ресуспендировали, переносили по 100 мкл в цитометрические пробирки и добавляли по 10 мкл моноклональных антител к поверхностным антигенам лейкоцитов периферической крови CD69-PE, CD11Bb-FITC, CD62L-FITC, CD38-PE, а также соответствующих изотипических контролей («Beckman Coulter»). Лизис эритроцитов производили с помощью раствора (BD FACSTM Lysing Solution). Клетки анализировали на проточном цитофлюориметре «FACS Calibur» (Becton Dickinson, США). Гейтирование субпопуляций гранулоцитов (основную часть которых составляют Нф), осуществляли по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию. В каждой пробе анализировали не менее 104 клеток. Результаты, отражающие плотность молекул на поверхности клеток, представлены в виде условных единиц средней интенсивности флюоресценции (MFI – mean fluorescence intensity).

Влияние образцов на фагоцитарную и бактерицидную активность исследовали по методике, описанной [3], с этой целью из крови здоровых доноров выделяли лейковзвесь путем седиментации эритроцитов и доводили до конечной концентрации 2х106/мл, клетки инкубировали с образцами при 37 °С в течение 1 часа и 20 час. Объектом фагоцитоза служил латекс 1,5 мкм (10 % полистерольная суспензия, ДИА-М, Россия) в разведении 1:80. Учет результатов осуществляли микроскопически путем подсчета 100 клеток. Полученные результаты оценивали по фагоцитарному показателю (ФП %) – процент клеток, участвующих в фагоцитозе и фагоцитарному числу (ФЧ) – среднее число латексных частиц, поглощенных одним фагоцитом. Бактерицидную активность Нф (продукцию активных форм кислорода) исследовали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) спектрофотометрическим методом. Результаты рассчитывали в виде разницы значений оптических плотностей, получаемых при длине волны 620 нм и 492 нм на спектрофотометре «Multiscan RC «Labsystems». В качестве контроля использовали лейковзвесь, инкубируемую в физиологическом растворе без имплантатов.

Статистическую обработку цифровых данных проводили с помощью пакета программы «Statistica-7». Критическое значение уровня значимости принималось равным 5 % (р < 0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

При инкубировании исследуемых образов имплантационных материалов с цельной кровью наблюдались выраженные изменения функционального состояния Нф, регистрируемые по экспрессии поверхностных антигенов. Так, при контакте в течение 20 час с образцами 1, 2 и 3 выявлено статистически значимое увеличение по сравнению с контролем плотности маркеров активации CD69 и CD38 и молекул CD11b, относящихся к семейству β2- интегринов, на мембране Нф. Кроме того активация Нф сопровождалась снижением плотности молекул L-селектина (CD62L), что является отражением процесса шеддинга (слущивания с мембраны) и свидетельствует о готовности Нф к миграции (табл. 1).

Таблица 1

Экспрессия поверхностных антигенов нейтрофильных лейкоцитов под влиянием имплантационных материалов

№ образца

Антигены (маркеры) клеточной мембраны (MFI)

CD69

CD11Bb

CD62L

CD38

1

25,6± 4,2*

1888± 380**

33,4±19,0**

27,5± 3,5*

2

24,4±2,8*

1853±67**

33,5±4,5**

26,5±3,5*

3

14,2±0,5**

1262±197*

59,4±21,5*

23,2±0,5*

4

8,5±2,1

563±24,3

99,8±11,5

17,5±2,1

Контроль (клетки без имплантатов)

7,5±0,7

573,5±9,1

105,6±25,0

15,5±0,7

Примечание. Показатели M±σ; n=5; * p < 0,05, ** p<0,01 (значимость различий по отношению к контрольным показателям).

Наибольшие показатели активации Нф наблюдались под влиянием технически чистого титана марки ВТ1-0 (образец 1) и покрытия на сплаве титана, нанесенного методом ПЭО (образец 2). Инкубирование клеток в присутствии покрытия, нанесенного путем погружения в суспензию, содержащую частицы УПТФЭ и последующей термообработки (образец 3) приводило к аналогичным изменениям в экспрессии поверхностных антигенов клеточной мембраны Нф. Под воздействием композиционного покрытия, полученного путем запечатывания пор ПЭО-слоя УПТФЭ, нанесенным электрофоретическим методом, (образец 4) показатели функциональной активности Нф значимо не отличались от таковых в контрольных образцах (табл. 1).

При исследовании фагоцитарной активности Нф было установлено, что по истечении 1 часа инкубирования лейковзвеси (контроль) с частицами латекса ФП составил 72,6±2,8 %; ФЧ – 2,8±0,29. В результате контакта лейкоцитов с образцами 1, 2 и 3 выявлено статистически значимое увеличение ФП и ФЧ (p < 0,05), при этом наибольшую стимуляцию поглотительной активности фагоцитов вызывал образец 1. При контакте Нф с образцом 4 показатели фагоцитарной активности значимо не отличались от контрольных (табл. 2).

Через 20 час инкубирования интактных Нф (контроль) функциональная активность снижалась. При контакте клеток с образцами 1, 2 и 3 показатели ФП и ФЧ значительно снижались по отношению к контрольным (p < 0,05), свидетельствуя об угнетении способности Нф к фагоцитозу. Показатели фагоцитарной активности Нф, инкубированных с образцом 4, значимо не отличались от таковых у интактных клеток (табл. 2).

В отношении показателей бактерицидной активности, регистрируемых в НСТ-тесте, выявлено, что под влиянием образцов 1 и 2 наблюдалось их статистически значимое увеличение по сравнению с контролем (p < 0,05), свидетельствующее об усилении продукции активных форм кислорода. При инкубировании лейковзвеси с образцами 3 и 4 показатели НСТ-теста не отличались от контрольных (табл. 2).

Таблица 2

Показатели фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофильных лейкоцитов под влиянием имплантационных материалов

№ образца

ФП ( %)

ФЧ (усл. ед.)

НСТ (ODx10-3)

 

1 час

20 час

1 час

20 час

1 час

1

90,4±5,6*

28,2±2,9*

4,1±0,26*

0,52±0,05*

0,842±0,04*

2

86,2±4,8*

36,2±3,3*

3,7±0,39*

0,75±0,04*

0,871±0,05*

3

88,8±5,9*

33,4±3,8*

3,9±0,35*

0,78±0,05*

0,624±0,06

4

74,2±3,8

57,6±3,7

3,2±0,32

1,51±0,08

0,605±0,04

Контроль (клетки

без имплантатов)

72,6±2,8

55,2±3,7

2,8±0,29

1,39±0,09

0,564±0,04

Примечание. Показатели М±m; n=5; * p < 0,05 (значимость различий по отношению к контрольным показателям).

При оценке биосовместимости имплантационных материалов важное значение имеет исследование реакции на имплантат клеток врожденного иммунитета, в частности Нф. Непосредственно после введения имплантатов, провоспалительные клетки, преимущественно Нф, мигрируют из крови к объекту имплантации. Движение (таксис) Нф начинается с серии адгезионных событий, каждое из которых связано с изменением экспрессии определенного типа поверхностных молекул и определяет дальнейшие особенности активации и осуществление эффекторных функций этих клеток [5]. Достигая имплантата, Нф взаимодействуют с его поверхностью, индуцируя фагоцитарную реакцию и дегрануляцию, продуцируют протеолитические ферменты, факторы активации моноцитов, макрофагов, незрелых дендритных клеток и лимфоцитов [7, 8], повреждая окружающие ткани и пролонгируя воспалительную реакцию, а также вызывая повреждение поверхности имплантационных материалов. Другим нежелательным (отрицательным) эффектом активации Нф биоматериалом является индуцированное метаболическое истощение и разрушение окислительных ресурсов Нф. Вследствие непрерывного высвобождения активных форм кислорода способность Нф к киллингу микробов резко снижается, что связано с индуцированными биоматериалом инфекциями [8, 9].

Выявленная нами активация Нф в результате их контакта с образцами имплантационных материалов 1, 2, 3 регистрировалась как по экспрессии поверхностных антигенов, так и при оценке фагоцитарной и бактерицидной функций. Активация Нф, наблюдаемая при краткосрочном контакте с образцами 1 и 2, сопровождалась последующим снижением показателей, что свидетельствует об истощении функциональных резервов клеток. В тоже время при инкубировании клеток с образцом 4 показатели функциональной активности Нф сохранялись на уровне интактного контроля на протяжении 20 часов контакта.

Заключение

Таким образом, в настоящем исследовании показано, что изменение поверхности имплантатов, улучшающее их остеогенный потенциал, не приводит к ухудшению показателей, характеризующих биосовместимость материала.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант 14-33-00009) и Федерального агентства научных организаций.