Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

В современной медицине широко используются искусственные материалы (имплантаты) для замены поврежденной костной ткани. Введение имплантата в организм всегда связано с риском микробного инфицирования. Инфекционные осложнения, источниками которых могут быть микроорганизмы, присутствующие в операционных, хирургический персонал, оборудование, резидентная микрофлора на коже пациента, очаги хронических инфекций внутри его организма, являются серьезной проблемой в ортопедии. Они требуют необходимости замены имплантата, а в тяжелых случаях, могут стать причиной ампутации конечности и смерти больного. В основе нежелательного влияния имплантационных материалов лежит каскад событий, проявляющихся в активации иммунокомпетентных клеток, усилении продукции цитокинов и протеолитических ферментов и др., характерных для воспалительной реакции и приводящих к развитию патологического состояния [6].

С учетом этого, имплантационные материалы должны соответствовать ряду требований: структурной и поверхностной совместимостью с тканями организма, способностью к биодеградации, свойствами по обеспечению диффузии питательных веществ и удалению продуктов жизнедеятельности клеток, антикоррозийностью, но прежде всего они должны быть нетоксичными и биологически инертными [4, 6]. К числу материалов, широко используемых в имплантационной хирургии относятся титан и его сплавы [1, 2].

С целью повышения прочности имплантационных материалов, улучшения процессов остеоинтеграции и предотвращения нежелательных реакций, на имплантат наносят покрытия, состоящие из родственных организму материалов. К таким покрытиям относятся соединения на основе фосфатов кальция (гидроксиапатиты), физические и химические свойства которых обеспечивают биосовместимость, стимуляцию остеогенеза и восстановление костной ткани [2, 4]. Для нанесения покрытий используют такие методы, как золь-гель технология, анодирование, электроосаждение, плазменное напыление, плазменное электролитическое оксидирование (ПЭО) и др. Метод ПЭО позволяет формировать на поверхности изделий слои, включающие в свой состав как элементы матрицы (оксидируемого металла), так и элементы электролита [2].

Ранее нами установлено, что пористая поверхность кальциево-фосфатных покрытий, сформированных на поверхности имплантатов методом ПЭО, по минеральному составу и механическим характеристикам приближается к характеристикам костной ткани и обеспечивает стимуляцию остеогенеза [1]. В то же время безопасность, биосовместимость и функциональность покрытий зависят от реакции иммунной системы на имплантат [6]. В этой связи актуален поиск имплантационных материалов, отвечающих предъявляемым к ним требованиям, в частности препятствующих развитию воспалительной реакции и патологического состояния. Понимание сложных взаимодействий организма человека и имплантатов вызывает необходимость исследования реакции иммунной системы и в первую очередь нейтрофильных лейкоцитов (Нф) как основных эффекторных клеток врожденного иммунитета.

Целью работы явилось изучение влияния биоактивных кальций-фосфатных покрытий, формируемых на технически чистом титане ВТ1-0 с использованием технологии ПЭО, на функциональную активность Нф периферической крови человека.

Материалы и методы исследования

В качестве материала для нанесения покрытия использовался технически чистый титан марки ВТ1-0 (Fe 0,25 %; Si 0,12 %; С 0,07 %; О 0,12 %; N 0,04 %; Н 0,01 %, остальное Ti). Перед оксидированием образцы покрытий в виде дисков с площадью поверхности 49 мм² и толщиной 1 мм обрабатывали механическим способом, освобождая поверхность от различных дефектов, промывали в дистиллированной воде и обезжиривали спиртом (образец 1). Плазменное электролитическое оксидирование проводили в биполярном режиме [1, 2] в электролите, содержащем 30 г/л глицерофосфата кальция (C₃H₇O₆P)Ca·2H₂O и 40 г/л ацетата кальция Ca(CH₃COOO)₂·H₂O (образец 2). Согласно данным рентгенофазового анализа, в состав покрытия входит гидроксиапатит Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂. Для запечатывания пор ПЭО-слоя и создания композиционного полимерсодежащего покрытия использовали ультрадисперсный политетрафторэтилен (УПТФЭ, торговая марка Форум^®), полученный методом термоградиентного синтеза (метод разработан в лаборатории фторидных материалов Института химии ДВО РАН). Нанесение полимера на ПЭО-покрытие осуществляли двумя способами. При использовании 1-го образцы на 15 секунд погружали в суспензию на основе изопропилового спирта, содержащую частицы УПТФЭ размером 0,2–0,6 мкм (100–150 г/л) и смачиватель ОП-10 (6,0–8,0 г/л). После полного испарения изопропилового спирта с поверхности, образец подвергали термической обработке при 200–250 °С в течение 3 минут (образец 3). При 2-ом способе нанесение полимера осуществляли электрофоретическим методом с последующей термообработкой композиционного покрытия в муфельной печи при 315 °С в течение 15 минут (образец 4). Концентрация частиц в используемой суспензии составляла 20 г/л. Напряжение электрофоретического осаждения частиц полимера на ПЭО-слой поддерживалось потенциостатически при значении 200 В.

Стерилизацию образцов осуществляли в 70 % этаноле в течение 30 минут, а затем в ламинаре под лампой УФО по 20 мин с каждой стороны образца.

Влияние покрытий на экспрессию поверхностных маркеров Нф осуществляли с использованием культуры лейкоцитов периферической крови здоровых доноров. Кровь разводили 1:2 полной питательной средой RPMI-1640, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 0,01 М HEPES, 200 мМ L-глутамина, 100мг/мл гентамицина, и вносили в стерильные пластиковые 24-луночные планшеты («CellStar») с образцами покрытий, инкубировали при 37°С в течение 20 час с 5 % СО₂, затем кровь ресуспендировали, переносили по 100 мкл в цитометрические пробирки и добавляли по 10 мкл моноклональных антител к поверхностным антигенам лейкоцитов периферической крови CD69-PE, CD11Bb-FITC, CD62L-FITC, CD38-PE, а также соответствующих изотипических контролей («Beckman Coulter»). Лизис эритроцитов производили с помощью раствора (BD FACS^TM Lysing Solution). Клетки анализировали на проточном цитофлюориметре «FACS Calibur» (Becton Dickinson, США). Гейтирование субпопуляций гранулоцитов (основную часть которых составляют Нф), осуществляли по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию. В каждой пробе анализировали не менее 10⁴ клеток. Результаты, отражающие плотность молекул на поверхности клеток, представлены в виде условных единиц средней интенсивности флюоресценции (MFI – mean fluorescence intensity).

Влияние образцов на фагоцитарную и бактерицидную активность исследовали по методике, описанной [3], с этой целью из крови здоровых доноров выделяли лейковзвесь путем седиментации эритроцитов и доводили до конечной концентрации 2х10⁶/мл, клетки инкубировали с образцами при 37 °С в течение 1 часа и 20 час. Объектом фагоцитоза служил латекс 1,5 мкм (10 % полистерольная суспензия, ДИА-М, Россия) в разведении 1:80. Учет результатов осуществляли микроскопически путем подсчета 100 клеток. Полученные результаты оценивали по фагоцитарному показателю (ФП %) – процент клеток, участвующих в фагоцитозе и фагоцитарному числу (ФЧ) – среднее число латексных частиц, поглощенных одним фагоцитом. Бактерицидную активность Нф (продукцию активных форм кислорода) исследовали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) спектрофотометрическим методом. Результаты рассчитывали в виде разницы значений оптических плотностей, получаемых при длине волны 620 нм и 492 нм на спектрофотометре «Multiscan RC «Labsystems». В качестве контроля использовали лейковзвесь, инкубируемую в физиологическом растворе без имплантатов.

Статистическую обработку цифровых данных проводили с помощью пакета программы «Statistica-7». Критическое значение уровня значимости принималось равным 5 % (р < 0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

При инкубировании исследуемых образов имплантационных материалов с цельной кровью наблюдались выраженные изменения функционального состояния Нф, регистрируемые по экспрессии поверхностных антигенов. Так, при контакте в течение 20 час с образцами 1, 2 и 3 выявлено статистически значимое увеличение по сравнению с контролем плотности маркеров активации CD69 и CD38 и молекул CD11b, относящихся к семейству β₂- интегринов, на мембране Нф. Кроме того активация Нф сопровождалась снижением плотности молекул L-селектина (CD62L), что является отражением процесса шеддинга (слущивания с мембраны) и свидетельствует о готовности Нф к миграции (табл. 1).

Таблица 1

Экспрессия поверхностных антигенов нейтрофильных лейкоцитов под влиянием имплантационных материалов

Примечание. Показатели M±σ; n=5; * p < 0,05, ** p<0,01 (значимость различий по отношению к контрольным показателям).

Наибольшие показатели активации Нф наблюдались под влиянием технически чистого титана марки ВТ1-0 (образец 1) и покрытия на сплаве титана, нанесенного методом ПЭО (образец 2). Инкубирование клеток в присутствии покрытия, нанесенного путем погружения в суспензию, содержащую частицы УПТФЭ и последующей термообработки (образец 3) приводило к аналогичным изменениям в экспрессии поверхностных антигенов клеточной мембраны Нф. Под воздействием композиционного покрытия, полученного путем запечатывания пор ПЭО-слоя УПТФЭ, нанесенным электрофоретическим методом, (образец 4) показатели функциональной активности Нф значимо не отличались от таковых в контрольных образцах (табл. 1).

При исследовании фагоцитарной активности Нф было установлено, что по истечении 1 часа инкубирования лейковзвеси (контроль) с частицами латекса ФП составил 72,6±2,8 %; ФЧ – 2,8±0,29. В результате контакта лейкоцитов с образцами 1, 2 и 3 выявлено статистически значимое увеличение ФП и ФЧ (p < 0,05), при этом наибольшую стимуляцию поглотительной активности фагоцитов вызывал образец 1. При контакте Нф с образцом 4 показатели фагоцитарной активности значимо не отличались от контрольных (табл. 2).

Через 20 час инкубирования интактных Нф (контроль) функциональная активность снижалась. При контакте клеток с образцами 1, 2 и 3 показатели ФП и ФЧ значительно снижались по отношению к контрольным (p < 0,05), свидетельствуя об угнетении способности Нф к фагоцитозу. Показатели фагоцитарной активности Нф, инкубированных с образцом 4, значимо не отличались от таковых у интактных клеток (табл. 2).

В отношении показателей бактерицидной активности, регистрируемых в НСТ-тесте, выявлено, что под влиянием образцов 1 и 2 наблюдалось их статистически значимое увеличение по сравнению с контролем (p < 0,05), свидетельствующее об усилении продукции активных форм кислорода. При инкубировании лейковзвеси с образцами 3 и 4 показатели НСТ-теста не отличались от контрольных (табл. 2).

Таблица 2

Показатели фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофильных лейкоцитов под влиянием имплантационных материалов

Примечание. Показатели М±m; n=5; * p < 0,05 (значимость различий по отношению к контрольным показателям).

При оценке биосовместимости имплантационных материалов важное значение имеет исследование реакции на имплантат клеток врожденного иммунитета, в частности Нф. Непосредственно после введения имплантатов, провоспалительные клетки, преимущественно Нф, мигрируют из крови к объекту имплантации. Движение (таксис) Нф начинается с серии адгезионных событий, каждое из которых связано с изменением экспрессии определенного типа поверхностных молекул и определяет дальнейшие особенности активации и осуществление эффекторных функций этих клеток [5]. Достигая имплантата, Нф взаимодействуют с его поверхностью, индуцируя фагоцитарную реакцию и дегрануляцию, продуцируют протеолитические ферменты, факторы активации моноцитов, макрофагов, незрелых дендритных клеток и лимфоцитов [7, 8], повреждая окружающие ткани и пролонгируя воспалительную реакцию, а также вызывая повреждение поверхности имплантационных материалов. Другим нежелательным (отрицательным) эффектом активации Нф биоматериалом является индуцированное метаболическое истощение и разрушение окислительных ресурсов Нф. Вследствие непрерывного высвобождения активных форм кислорода способность Нф к киллингу микробов резко снижается, что связано с индуцированными биоматериалом инфекциями [8, 9].

Выявленная нами активация Нф в результате их контакта с образцами имплантационных материалов 1, 2, 3 регистрировалась как по экспрессии поверхностных антигенов, так и при оценке фагоцитарной и бактерицидной функций. Активация Нф, наблюдаемая при краткосрочном контакте с образцами 1 и 2, сопровождалась последующим снижением показателей, что свидетельствует об истощении функциональных резервов клеток. В тоже время при инкубировании клеток с образцом 4 показатели функциональной активности Нф сохранялись на уровне интактного контроля на протяжении 20 часов контакта.

Заключение

Таким образом, в настоящем исследовании показано, что изменение поверхности имплантатов, улучшающее их остеогенный потенциал, не приводит к ухудшению показателей, характеризующих биосовместимость материала.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (грант 14-33-00009) и Федерального агентства научных организаций.