Известно о существовании выраженных индивидуальных различий чувствительности к стрессорным нагрузкам в популяции [3; 13]. Механизмы различной устойчивости к стрессу остаются во многом неизученными. Она зависит от ряда генетических факторов, также определяется неблагоприятными жизненными обстоятельствами, которые организм пережил в детском или взрослом возрасте [7]. Животные с различной устойчивостью к стрессу различаются особенностями электрической активности мозга [6], уровнем кортикостерона в плазме крови [4; 10]. Фундаментальная роль при этом принадлежит гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе, нарушения в ее работе обнаруживаются у 50 % больных депрессией [11]. Регуляция гипоталамо-гипофизарной оси в значительной мере обеспечивается глюкокортикоидами в головном мозгу. Кортикостерон обнаружен в цереброспинальной жидкости организма [9], однако его роль в организации механизмов стресса недостаточно изучена. Будучи липофильными соединениями, глюкокортикоиды легко проникают через клеточные мембраны и, несмотря на наличие гематоэнцефалического барьера, кортикостерон способен проникать в мозг. В связи с этим целью исследования стало изучение динамики концентрации кортикостерона в плазме крови и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) у крыс с разным поведением в тесте открытого поля при стрессорной нагрузке.
Материалы и методы исследования
В работе были использованы 20 крыс самцов Вистар массой 280–320 г. Животных содержали в условиях свободного доступа к пище и воде, а исследования проводили в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals».
Оценку поведения животных проводили в тесте «открытое поле». После чего осуществляли расчет индекса двигательной активности (ИА) как отношения суммы пересеченных периферических и центральных секторов к сумме латентных периодов первого движения и выхода в центр. К активным (прогностически устойчивым к стрессу) особям были отнесены 14 животных со значением ИА менее 0,8, к пассивным (прогностически предрасположенным к стрессу) – 4 крысы с ИА более 1,5 [1].
Первый забор крови из хвостовой вены осуществляли с использованием кратковременной эфирной анестезии. Плазму отделяли центрифугированием (3000 оборотов/мин в течение 3 мин) и хранили при –80 °С. Через двое суток животных помещали в условия конфликтной ситуации, порождающей у них эмоциональный стресс. Ее моделировали с помощью тесного пенала, вызывающего трехчасовую иммобилизацию. В течение этого времени осуществляли постоянный мониторинг АД и ЧСС с помощью неинвазивного метода на установке TSE Non-Invasive Blood Pressure Monitoring System «Fully-Automated», Germany. При этом регистрировали систолическое, диастолическое, среднее ((2(АДд) + АДс)/3, где АДд – это диастолическое давление, а АДс – систолическое давление) и пульсовое давление крови, ЧСС. После стрессорной нагрузки осуществляли забор цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) у животных под анестезией хлоралгидратом из большой цистерны головного мозга по ранее разработанной методике [2]. Полученные образцы ликвора быстро замораживали и хранили при –20 °С.
Затем проводили повторный забор крови после декапитации животных. Исследование уровня кортикостерона в плазме крови и ликворе в контроле и после стресса проводили методом ИФА с использованием тест-системы «IDS Corticosterone EIA» (Великобритания) на ИФА ридере Multiscan EX (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) в соответствии с протоколом производителя. Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программного пакета Statistica 6.0. Для проверки гипотезы о различии независимых выборок использовали непараметрические методы статистического анализа, U-критерий Манна – Уитни и коэффициент корреляции Спирмена.
Результаты исследования и их обсуждение
У животных с высокой и низкой поведенческой активностью в тесте открытого поля концентрация кортикостерона в плазме крови достоверно отличалась по данным первого забора крови в обычных условиях домашней клетки. У высокоактивных (прогностически устойчивых в условиях стрессорного напряжения) животных [1] средняя концентрация кортикостерона в плазме крови составила 261,6 ± 34,9 нг/мл. У пассивных в открытом поле (предрасположенных к стрессу) особей средняя концентрация кортикостерона равнялась 421,2 ± 78,0 нг/мл (рисунок). Таким образом, животные из группы активных отличаются достоверно меньшей концентрацией кортикостерона в плазме крови по сравнению с пассивными крысами (р < 0,05).
Концентрация кортикостерона в крови у активных и пассивных животных в состоянии покая и после стресса, где * – р < 0,05 по сравнению с активными крысами, ** – p < 0,001 по сравнению с концентрацией кортикостерона до стресса
Средняя концентрация кортикостерона в плазме у активных и пассивных животных в обычных условиях содержания составила 301,5 ± 36,0 нг/мл, а после стрессорной нагрузки средний уровень кортикостерона у этих крыс достоверно (p < 0,005) вырос до 491,7 ± 45,5 нг/мл. Однако у пяти животных из восемнадцати был обнаружен прямо противоположный эффект – уменьшение уровня кортикостерона в плазме крови после иммобилизации.
После трехчасовой иммобилизации средний уровень кортикостерона в плазме крови составил у активных крыс 498,9 ± 52,7 нг/мл, у пассивных животных 466,4 ± 102,4 нг/мл (рисунок). У активных крыс после стрессорной нагрузки отмечено достоверное (p < 0,001) увеличение средней концентрации кортикостерона в плазме крови, у пассивных животных средний уровень кортикостерона плазмы достоверно не изменился.
Не наблюдалось достоверных отличий в уровне кортикостерона в ЦСЖ у активных и пассивных животных. Средняя концентрация кортикостерона в ЦСЖ у активных крыс равна 16,0 ± 3,5 нг/мл, а у пассивных животных 14,5 ± 4,2 нг/мл. Средний объем образца ЦСЖ, выделенного у активных крыс составил 107,6 ± 11,6 мкл, а у пассивных 131,5 ± 15,4 мкл.
Стрессорная нагрузка, по литературным данным, вызывает достоверное увеличение уровня кортикостерона в плазме крови у крыс [10; 12], однако у пяти животных был обнаружен противоположный эффект – уменьшение уровня кортикостерона в плазме крови. Таким образом, трехчасовая иммобилизационная стрессорная нагрузка неодинаково влияет на индивидуальные значения уровня кортикостерона в плазме крови у различных крыс. Хотя средняя его концентрация в этих условиях достоверно возросла, но у 30 % особей уровень кортикостерона, наоборот, снизился. Корреляция между уровнем этого гормона после стресса с исходным его уровнем в обычных условиях содержания (коэффициент корреляции Спирмена – 0,18) не обнаружена. Данные факты мы объясняем выраженными и неучтенными в настоящем исследовании ритмическими колебаниями концентрации кортикостерона в течение суток. Как известно, в результате ультрадианных ритмов содержание кортикостерона в плазме крови может изменяться в несколько раз, что может вносить существенный вклад в результаты измерений уровня кортикостерона при обычных нестрессорных условиях [15].
В нашем исследовании показано, что активные в открытом поле животные характеризуются меньшей концентрацией кортикостерона в плазме крови по сравнению с малоподвижными особями. При этом иммобилизационный стресс вызывает достоверное увеличение концентрации кортикостерона лишь у группы активных крыс.
В аналогичном исследовании зарубежного коллектива [8]) были использованы крысы двух генетически разнородных линий с высоко (HAB) и низко тревожным фенотипом (LAB). Данные этой работы полностью совпадают с нашими результатами. Достоверное увеличение уровня кортикостерона в плазме крови обнаружено только у низкотревожных особей, которые являлись также более активными в тесте открытого поля.
Полученные в нашей работе данные относительно содержания кортикостерона в плазме крови у активных и пассивных в открытом поле животных совпали и с данными другого исследования [4], в котором также было показано, что пассивные крысы отличаются более высокой концентрацией этого гормона в плазме крови.
Взаимосвязь между уровнем кортикостерона в крови у крыс с поведением животных была изучена в работе Tilahun A. с соавторами (2009). Однако им не удалось обнаружить значительной связи между концентрацией кортикостерона и поведением, мы предполагаем, что может быть связано с использованием в качестве модели стресса менее продолжительной нагрузки – теста 15-минутного плавания [14].
Заключение
Таким образом, нами было выявлено различие уровня кортикостерона крови в условиях покоя и после стрессорной нагрузки у поведенчески активных (прогностически устойчивых к стрессу) и пассивных (предрасположенных к стрессу) животных. При этом у активных особей наблюдался более низкий исходный уровень этого гормона в крови, по сравнению с пассивными животными, достоверно повышающийся после стрессорной нагрузки. У пассивных крыс не наблюдалось увеличение концентрации кортикостерона в крови в стрессорных условиях. Уровень кортикостерона в ЦСЖ после иммобилизационного стресса не отличался у активных и пассивных особей.