Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Моноаминомонокарбоновые аминокислоты – аланин, валин, глицин по структурным особенностям относятся к алифатическим [7]. Эти аминокислоты являются важными источниками энергии для головного мозга, центральной нервной системы и участвуют в поддержании тонуса мышц. Аланин, кроме того, регулирует уровень сахара в крови, участвует в синтезе антител, стимулируя иммунитет. При поступлении в организм в достаточной концентрации аланин повышает количество карнозина, который нормализует кислотно-щелочное равновесие в тканях мышц, усиливает антиоксидантные защитные функции организма, расширяет кровеносные сосуды, освобождая в эндотелии NO [9], купирует сосудистый пароксизм. Показано, что энергия связывания рецептором бета-аланина превышает энергию связывания глицина, что соответствует пролонгированному по сравнению с глицином воздействию препаратов бета-аланина на глициновые рецепторы и более длительной способности оказывать нормализующее действие на терморегуляцию и вазомоторику [6]. Значительное количество аминокислот, в том числе глицина, содержится в клетках сердечной мышцы и способствует нормальной работоспособности сердца и снижению уровня триглицеридов, а также повышает шансы на выживание после инфаркта миокарда [5]. Такая незаменимая аминокислота, как валин, вызывает расширение кровеносных сосудов, облегчая симптоматику стенокардии, является одним из главных компонентов роста и синтеза тканей тела. Он необходим для метаболизма мышц в качестве источника энергии и восстановления поврежденных тканей. Валин улучшает работу печени, снижает уровень сахара и повышенное содержание холестерина в крови [7].

Природный антикоагулянт крови гепарин, представляющий собой гликозаминогликан с кислыми сульфо- и карбоксильными группировками, нормализует уровень холестерина и сахара в крови и увеличивает скорость заживления ран в организме [1]. Он проявляет антикоагулянтную активность вследствие блокады свертывающей активности тромбина и других коагуляционных белков [10].

Экспериментальные данные, подтвержденные затем в клинических условиях, свидетельствуют об усилении противосвертывающих и антидиабетогенных свойств комплексных соединений гепарина с некоторыми аминокислотами и пептидами [3, 4].

Цель исследования заключалась в создании комплексных соединений алифатических аминокислот (аланин, глицин, валин) с гепарином и сравнительном изучении их влияния на полимеризацию фибрина и антикоагулянтную активность плазмы крови крыс в условиях in vitro и in situ.

Материалы и методы исследования

В экспериментах использовали высокомолекулярный гепарин фирмы «Serva» (США), препараты аминокислот – аланин, валин и глицин производства «Reanal» (Венгрия).

Разработанным нами методом получали комплексные соединения аланина с гепарином (АГ), глицина с гепарином (ГГ) и валина с гепарином (ВГ) при эквимолярном соотношении составных частей. Комплексообразование контролировали методом перекрестного электрофореза [4].

В условиях in vitro проводили определение собственной неферментативной фибринолитической (фибриндеполимеризационной) активности [3] комплексных соединений АГ, ГГ и ВГ в пределах концентраций от 10^–6 до 10^–1 М без добавления плазмы крови на пластинах нестабилизированного фибрина как в отсутствии, так и присутствии блокаторов ферментативного фибринолиза (Σ-аминокапроновой кислоты, антиплазмина, ингибитора трипсина и соевых бобов) [2]. Проведены эксперименты in situ, заключающиеся в том, что к нормальной плазме крови здоровых половозрелых крыс (вес 180–200 г, самцы) добавляли различные концентрации комплексных препаратов (от 10^–6 до 10^–1 М) и их составных частей (аланина, глицина, валина и гепарина) в количествах, эквивалентных их содержанию в комплексах. Добавление препаратов к плазме крови производили в следующей пропорции – к 0,2 мл плазмы приливали 0,05 мл препаратов, перемешивали и инкубировали при 37 °С в течение 12–15 мин. После этого проводили определение антикоагулянтных (по тесту активированного частичного тромбопластинового времени – АЧТВ и тромбинового времени – ТВ) на анализаторе гемостаза Астра (Россия) и фибринолитических (по тесту фибриндеполимеризационной активности) свойств плазмы крови крыс [2].

Результаты исследования и их обсуждение

Прежде всего, методом перекрестного электрофореза было доказано образование комплексных соединений гепарина с аланином, глицином и валином при физиологическом рН (7,2–7,4). Об этом свидетельствовало исчезновение окраски на кислые группы гепарина в месте пересечения двух растворов – гепарина и аминокислоты, нанесенных перпендикулярно друг к другу, при их передвижении в электрическом поле. Обнаружено участие аминогрупп каждой из аминокислот (окраска 0,05 %-ным раствором нингидрина) во взаимодействии с кислыми карбоксильными или сульфатными группами гепарина (окраска 0/033 %-ным раствором Азура А).

В экспериментах in situ, после инкубации АГ, ГГ и ВГ с плазмой крови здоровых животных, выявлена антикоагулянтная активность комплексных препаратов (по тесту АЧТВ) при их концентрации в плазменной среде от 10^–3 до 10^–1 М, так как они удлиняли время образования сгустка в 1,5–4,0 раза по сравнению с контролем (образец с 0,85 %-ным раствором NaCl). Дополнительно к этому ВГ в концентрации 10^–4 М также проявлял антикоагулянтную активность, превышающую контрольный уровень в 2,2 раза. Из составных частей исследуемых комплексов только гепарин в концентрациях 10^–1 и 10^–2 М обнаруживал антикоагулянтную активность (АЧТВ удлинялось в 1,5–2,0 раза), в то время как аминокислоты не проявляли такого действия. По тесту тромбинового времени (ТВ) все комплексные соединения обладали способностью проявлять антикоагулянтное действие путем ингибирования активности тромбина в диапазоне концентраций от 10^–4 до 10^–1 М, удлиняя время образования фибринового сгустка в 1,3–2,6 раза. В этих условиях комплекс ВГ более значительно, чем АГ и ГГ, удлинял время образования фибринового сгустка (в 2,2–2,6 раза). Из составных частей комплексных соединений только гепарин проявлял ингибирующий эффект в отношении фермента тромбина, удлиняя ТВ в 1,5–1,9 раза при его концентрациях в системе 10^–1 и 10^–2 М, а у аминокислот антитромбинового действия не установлено. При изучении способности комплексов влиять на полимеризацию фибрина в присутствии плазмы крови здоровых животных было показано, что все они повышали фибриндеполимеризационную активность (разновидность фибринолиза) в пределах концентраций от 10^–1 до 10^–3 М в 2,1–4,5 раза по сравнению с контролем (0,85 %-ный раствор NaCl), причем как в отсутствии, так и в присутствии блокаторов ферментативного фибринолиза. По степени выраженности фибриндеполимеризационного эффекта максимальным действием обладал препарат ВГ, а минимальным – ГГ (табл. 1).

Таблица 1

Антикоагулянтная (по тестам АЧТВ, ТВ) и фибриндеполимеризационная активности комплексных соединений гепарина с аланином, глицином, валином и их составных частей в эквивалентных концентрациях в плазменной среде в условиях in situ (М ± m)

Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля с NaCl. Обозначения: **р < 0,01; *р < 0,05.

В других экспериментах выявляли собственную фибринолитическую (фибриндеполимеризационную) активность. Установлено, что в условиях in vitro сами комплексные соединения АГ, ГГ и ВГ (в отсутствии плазмы крови) проявляли фибриндеполимеризационный эффект в широком пределе концентраций от 10^–4 до 10^–1 М, в то время как и аминокислоты, и гепарин таким действием не обладали. Показано, что на пленках нестабилизированного фибрина (в отсутствии фактора XIIIa) даже в присутствии в среде ингибиторов ферментативного фибринолиза, например, Σ–аминокапроновой кислоты, зоны лизиса выявлялись только после действия комплексов, но не после воздействия их составных частей (табл. 2).

Таблица 2

Собственная фибриндеполимеризационная активность комплексных соединений гепарина с аланином, глицином, валином и их составных частей в эквивалентных концентрациях в условиях in vitro (М ± m)

Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля с NaCl. Обозначения: **р < 0,01; *р < 0,05.

Анализируя полученные результаты, необходимо отметить, что из всех исследуемых комплексных препаратов наибольшие антикоагулянтный, антитромбиновый и фибриндеполимеризационный эффекты обнаружены у комплекса ВГ. Возможно, это обусловлено с одной стороны структурными особенностями комплексов, а с другой – действием самих аминокислот. Так, количество СН3-групп в молекулах аминокислот, вступающих в реакцию комплексообразования, разное: в глицине этих групп нет, в аланине – одна, а в валине – две.

Ранее было обнаружено усиление антикоагулянтной активности плазмы крови за счет действия таких комплексов, как аргинин-гепарин [3], глутаминовая кислота-гепарин [8], однако у исследованных нами комплексов этот же факт установлен впервые. Дополнительно впервые представлены результаты наличия у указанных комплексных соединений собственной фибриндеполимеризационной активности.

Следовательно, в условиях in situ соединения АГ и ВГ отличались от ГГ более значительным антикоагулянтным и фибриндеполимеризационным фибринолитическим эффектом. Кроме того, препараты комплексов гепарина с исследуемыми аминокислотами обладали собственной фибриндеполимеризационной активностью в условиях in vitro, причем в большей степени это наблюдалось при действии комплекса ВГ, имеющего две метильные группировки.

Заключение

В настоящей работе продемонстрировано, что гликозаминогликан гепарин, обладающий избытком кислых сульфо- и карбоксильных групп, взаимодействует с алифатическими аминокислотами с образованием комплексных соединений. Эти комплексы образуются при участии кислых групп гепарина и аминогрупп аминокислот. Установлен значительный антикоагулянтно-фибринолитический эффект комплексных соединений аланин-гепарин, валин-гепарин и глицин-гепарин по сравнению с их составными частями: при добавлении к нормальной плазме крови животных этих соединений обнаруживалась фибриндеполимеризационная активность, которая сохранялась даже при дополнительном добавлении к плазме крови ингибиторов ферментативного фибринолиза, а также антикоагулянтная активность, выявляемая по тестам АЧТВ и тромбинового времени. В перспективе комплексные соединения гепарина могут быть применены при нарушениях свертываемости крови, сопровождающимися процессами тромбообразования.