Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) – одно их самых распространенных природно-очаговых заболеваний в России, вызываемых спирохетами комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.). В нашей стране природные очаги этой инфекции широко распространены в лесной зоне, от границ с Прибалтикой на западе до Южного Сахалина – на востоке [2]. В связи с наблюдаемым в последние годы широким распространением высокоактивных природных очагов ИКБ на территории РФ, а также неуклонным ростом заболеваемости особую важность приобретают вопросы диагностики этой инфекции. В клинической практике одним из наиболее распространенных и доступных серологических тестов на ИКБ является метод иммуноферментного анализа (ИФА). В современных иммуноферментных тест-системах в качестве антигена используют преимущественно рекомбинантные белки или их фрагменты из патогенных видов боррелий, эпидемически значимых для конкретной территории [6, 10]. Одним из новых подходов по улучшению серодиагностики ИКБ является использование в лабораторных тестах в качестве антигена полипептидов, содержащих эпитопы нескольких гомологичных или гетерологичных иммунодоминантных белков B.burgdorferi s.l. [3, 7]. В связи с изложенным, целью настоящего исследования явилось получение и оценка антигенной активности рекомбинантного химерного полипептида OspC (OspCgar+afz), содержащего эпитопы иммунодоминантных белков OspC западно-сибирских изолятов B.garinii и B.afzelii для возможного его использования в серодиагностике ИКБ.

Материалы и методы исследования

Источником генов кодирующих химерный полипептид OspCgar+afz служили западно-сибирские изоляты спирохет B.garinii 20047Т и B.afzelii. Изоляты спирохет были получены из клещей, отловленных в лесопарковой зоне г. Новосибирска [4]. Для клонирования рекомбинантных ДНК, кодирующих химерный полипептид OspCgar+afz были использованы клетки E.coli штамма BL21(DE3) и модифицированный экспрессирующий вектор pETm [5]. Клетки выращивали при 37°С в присутствии канамицина 30 мкг/мл до оптической плотности 1,0±0,1 о.е., затем добавляли изопропил-β-D-1-тиогалактопироназида (ИПТГ) до 1мМ и продолжали инкубацию клеток в течение 12–16 часов при 30°С. Клетки осаждали центрифугированием (3000 об./мин, 15 мин) и хранили при минус 20°С. Выделение и очистку химерного полипептида OspCgar+afz осуществляли с помощью аффинной хроматографии лизата клеток на колонке с Ni-NTA-сефарозой CL-6B согласно протоколу фирмы-производителя сорбента («Qiagen», Германия). Количество белка определяли методом Лоури, используя для построения калибровочной кривой бычий сывороточный альбумин и IgG собаки. Чистота химерного полипептида OspCgar+afz по данным электрофореза в SDS-ПААГ составляла не менее 90 %. Антигены хранили в буферном растворе, содержащем 10 мМ Трис-HCL, рН 7.5; 300 мM NaCl; 20 мM 2-меркаптоэтанол и 0.05 % NaN3.

Для изучения антигенных свойств химерного полипептида OspCgar+afz методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) использовали панель сывороток крови больных ИКБ с мигрирующей эритемой (локализованная стадия инфекции) (n=36) и без мигрирующей эритемой (диссеминированная стадия инфекции) (n=19). Сыворотки больных ИКБ были получены из муниципальной инфекционной клинической больницы № 1 и областного диагностического центра г. Новосибирска. Диагноз у больных ИКБ с локализованной стадией инфекции установлен на основе анамнеза (укус клеща), наличия мигрирующей эритемы и данных клинического обследования. У больных ИКБ с диссеминированной стадией инфекции в анамнезе отмечен укус клеща и наблюдалась моно – или полиорганная симптоматика, характерная для диссеминированной формы заболевания. Диагноз ИКБ лабораторно подтвержден ИФА с помощью коммерческих иммуноферментных тест-систем «ЛаймБест-IgM» и «ЛаймБест-IgG» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Все сыворотки больных ИКБ в IgM ИФА и IgG ИФА были положительными. При комплексном исследовании сывороток больных ИКБ не обнаружено специфических IgM и IgG антител к спирохетам Tripanema pallidum и вирусу клещевого энцефалита. Для определения неспецифических перекрестных реакций в качестве отрицательного контроля использовали сыворотки здоровых доноров (n=30), больных сифилисом (n=20) и больных ревматоидным артритом (n=12). Контрольные отрицательные сыворотки были отрицательными в ИФА. Сыворотки до исследования хранили при температуре минус 70°С.

Постановку IgM ИФА и IgG ИФА осуществляли в режимах по описанной ранее методике [1]. Для определения специфического комплекса антиген-антитело использовали пероксидазные конъюгаты на основе мышиных моноклональных антител против IgM и IgG человека. Рабочие разведения этих реагентов составили: для анти-IgM антител 1:3000, для анти-IgG антител 1:4000. Для подсчета критической оптической плотности (ОПкрит) антигена использовали 30 отрицательных образцов сывороток здоровых доноров. ОПкрит устанавливали статистически как среднее значение ОП для группы здоровых доноров и 2-х стандартных отклонений, что соответствовало верхней границе 95 % доверительного интервала для возможных значений показателя. Исходя, из критической величины ОП с антигеном OspC gar+afz, проводился анализ результатов тестирования исследуемых сывороток. Образцы считали положительными, если результат превышал пороговое значение ОПкрит в двух из трех независимых экспериментах. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программы «StatPlus 2009» (компания «StatSoft», USA).

Результаты исследования и их обсуждение

Для конструирования химерного полипептида OspCgar+afz был выбран поверхностный белок боррелий OspC, который является основным антигеном, вызывающим иммунный ответ на ранних стадиях заболевания ИКБ и присутствует во всех без исключения патогенных штаммах B.burgdorferi s.l. [10]. В работах ряда авторов представлены данные об использовании антигенов OspC в качестве маркеров для серодиагностики ИКБ [8, 9]. Этот белок характеризуется высокой гетерогенностью аминокислотных последовательностей, оказывающей влияние на антигенную структуру OspC. Показано, что при использовании в качестве антигена рекомбинантных белков OspC геновида B.garinii и B.afzelii, циркулирующих в популяции клещей Западной Сибири, значительно повышается чувствительность анализов методом ИФА [1].

Ранее фрагменты кодирующих областей генов OspC западносибирских изолятов B.garinii (OspCgar) и B.afzelii (OspCafz) были клонированы в клетках E.coli в составе вектора pETm. При сравнительном структурном анализе гомология аминокислотных последовательностей рекомбинантных белков OspCgar и OspCafz составила 67 %. что указывало на наличие отличающихся эпитопов у этих полипептидов [5]. Установленные нуклеотидные последовательности фрагментов генов OspCgar и OspCafz западносибирских изолятов B.burgdorferi s.l. и кодируемые этими генами аминокислотные последовательности депонированы в Международной электронной базе данных «GenBank» под номерами: OspCgar – EU979626 и OspCafz – EU979627, соответственно.

Нами сконструирована рекомбинантная ДНК, кодирующая химерный полипептид OspCgar+afz, содержащий полноразмерные аминокислотные последовательности зрелых белков OspC двух изолятов спирохет B.garinii и B.afzelii, циркулирующих на территории Западной Сибири. Согласно расчётам химерный полипептид OspCgar+afz должен содержать 390 аминокислотных остатков и иметь молекулярную массу равную 40,83 кДа.

Для получения гена химерного полипептида OspCgar+afz 3’ – конец клонированного гена зрелого белка OspCgar в составе модифицированного экспрессирующего вектора pETm состыковывали с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4 с 5’-концом ампликона гена зрелого белка OspCafz. По данным электрофоретического анализа ген химерного полипептида OspCgar+afz имел размер 1170 п.н. Об экспрессии химерного гена полипептида OspCgar+afz судили по присутствию на электрофореграммах в лизатах клеток штамма-продуцента целевого белка с молекулярной массой около 40,8 кДа. Таким образом, полученная конструкция обеспечивала биосинтез химерного полипептида OspCgar+afz, содержащего аминокислотные последовательности зрелых белков OspCafz и OspCgar [3].

На первом этапе работы по изучению антигенной активности химерный рекомбинантный полипептид OspCgar+afz был исследован с помощью вестерн-блот анализа со смесью сывороток крови больных ИКБ в титре 1:100. В качестве отрицательного контроля использовали лизаты клеток E. coli BL21 (DE3), несущих вектор без вставки гена OspCgar+afz. Вестерн-блот анализ продемонстрировал специфичность связывания антител сывороток больных ИКБ с OspCgar+afz. В аналогичном эксперименте этот полипептид не реагировал с антителами сывороток здоровых доноров.

Полученные результаты позволили приступить к оценке антигенной активности и специфичности химерного полипептида OspCgar+afz по его способности взаимодействовать с антителами сывороток крови больных ИКБ, здоровых доноров, больных сифилисом и ревматоидным артритом. При исследовании в ИФА сывороток здоровых доноров на наличие IgM и IgG специфических к антигену OspCgar+afz была предварительно определена ОПкрит. Кроме, того показано, что оптимальная концентрация антигена OspCgar+afz. для сорбции на полистироловый носитель составляет 2 мкг/мл. Результаты определения специфических IgM и IgG антител к химерному полипептиду OspCgar+afz в сыворотках больных ИКБ и контрольных сыворотках приведены в таблице.

Специфические IgM и IgG антитела к химерному полипептиду OspCgar+afz в сыворотках больных ИКБ и контрольных сыворотках

n – количество исследуемых образцов сывороток; ИКБ – больные иксодовым клещевым боррелиозом; БС – больные сифилисом; БРА – больные ревматоидным артритом; ЗД – здоровые доноры.

Как видно из данных таблицы из 36-ти образцов сывороток крови больных ИКБ с локализованной стадией инфекции на наличие IgM антител к антигену OspCgar+afz 21 (58,3 %) сыворотки были положительными. Из 19 сывороток больных ИКБ с диссеминированной стадией инфекции специфические IgM антитела к OspCgar+afz выявлены в 11-ти (57,9 %) сыворотках. При тестировании в IgG ИФА 36-ти образцов сывороток больных ИКБ с локализованной стадией инфекции и 19-ти образцов сывороток больных ИКБ диссеминированной стадией инфекции положительные результаты были выявлены более чем в 50 % сывороток. Специфические IgG антитела к антигену OspCgar+afz обнаруживали в 19 (52,7 %) сыворотках больных ИКБ с локализованной стадией инфекции и в 13-ти (68,4 %) сыворотках больных ИКБ диссеминированной стадией инфекции. Следует отметить, что количество позитивных результатов при исследовании сывороток больных с диссеминированной стадией инфекции в IgG ИФА было выше, чем в IgM ИФА. Можно предположить, что химерный полипептид OspCgar+afz более пригоден для обнаружения IgM антител у больных ИБК с локализованной стадии инфекции и для обнаружения IgG антител у больных с диссеминированной стадией инфекции. По результатам исследований специфические антитела к антигену OspCgar+afz определялись в сыворотках большинства больных ИКБ. Однако, даже использование антигена OspCgar+afz не способно выявить все положительные сыворотки больных ИКБ. Иными словами, чем больше специфических антигенов будет вовлечено в исследование, тем больше будет надежность и достоверность такого анализа.

По результатам исследования в IgM ИФА и IgG ИФА контрольных отрицательных сывороток (здоровых доноров, больных сифилисом и ревматоидным артритом) мы наблюдали высокие показатели диагностической специфичности химерного полипептида OspCgar+afz.. При исследовании этих сывороток в IgM ИФА и IgG ИФА с антигеном OspCgar+afz не было получено ни одного ложноположительного результата. Из этого следует, что химерный полипептид OspCgar+afz не содержит эпитопов перекрещивающихся с эпитопами других антигенов, вследствие чего не дает неспецифических сигналов в иммуноферментном анализе. Это, в свою очередь, обеспечивает повышение специфичности диагностики ИКБ. Следует отметить, что полученные результаты расходятся с ожидаемыми показателями чувствительности анализа, спрогнозированными нами ранее на основе анализа индивидуальных антигенов с сыворотками больных ИКБ на различных стадиях заболевания [5]. Вероятно, такое различие можно объяснить неоднородностью панелей сывороток, на которых проводились исследования ранее и в настоящей работе.

Выводы

Сконструирован штамм E. coli – продуцент химерного полипептида OspCgar+afz, содержащего состыкованные между собой аминокислотные последовательности зрелых белков OspCgar и OspCafz. Продемонстрирована антигенная активность химерного полипептида OspCgar+afz методом ИФА в экспериментах с сыворотками больных ИКБ, что свидетельствует о перспективности его использования для серодиагностики ИКБ.