В настоящее время все широко используют пересадку костного мозга для лечения онкологических заболеваний [4,6,7]. Полагают, что важным механизмом коррекции органных дисфункций при трансплантации клеток костного мозга служит продуцирование этими клетками различных нейромедиаторов, в том числе иммунной системы, так как костный мозг является центральным органом иммуногенеза в организме и играет ведущую роль в восстановлении иммунного гомеостаза. По данным многих авторов [1,2, 3, 5] основными клетками, содержащими биогенные амины, такие как гистамин, катехоламины и серотонин, считаются тучные клетки и гранулярные люминесцирующие клетки, тесно связанные с вегетативной нервной системой, ее адренергическим и парасимпатическим звеном. Эти структуры являются местными регуляторами процессов, происходящих в органах.
Цель исследования: провести сравнительный анализ нейроаминного состава костного мозга при ауто- и аллотрансплантации.
Материалы и методы исследования
Исследовали 2 группы животных:
1 группа – аутогенная пересадка костного мозга- животным этой группы внутривенно вводили суспензию костного мозга, полученную от этой же мыши.
2 – аллогенная – животным этой группы также внутривенно вводили суспензию костного мозга, но полученную от мыши другой линии.
Нами использовались следующие методы исследования: Люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Евена, Роста (Cross S.A., Even S.W., Rost F.W., 1971) для выявления тканевого гистамина. Для выявления аминосодержащих структур применялся люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа в модификации Е.М. Крохиной (1969). Количественно концентрации КА, СТ, гистамина в структурах оценивались с применением микрофлуориметрической насадки. Представление о количественном распределении ТК и ГЛК дает метод подсчета их в 5 полях зрения микроскопа при увеличении об. 40 ок. 10. Окраска полихромным толуидиновым синим по Унна применяли для определения степени сульфатированности гепарина и состояния тучных клеток (Ромейс Б., 1954). Методом Массона-Фонтаны выявляли индолсодержащие вещества предшественники серотонина. Статистическую достоверность определяли критерием Стьюдента (т). Полученные цифровые данные обрабатывались статистически по специально разработанной программе «Statistica», версия 6 (Copyright@Stat Soft, 19842001, ИПЧИ 31415926535897). Иммуногистохимическое исследование с антителами к синаптофизину (SYN), нейроспецифической енолазе (Производство Daco, USA) для выяснения принадлежности структур к АПУД- системе. Ядра клеток докрашивались гематоксилином. Подсчитывалось количество иммуноположительных клеток на квадратный миллиметр. Миелограмму исследовали в расчете на 500 клеток после окраски препаратов по Паппенгейму.
Результаты исследований и их обсуждение
При изучении содержания нейроаминов в ГЛК в костном мозге через 40 мин после аутотрансплантации выявлено увеличение КА и СТ, число ГЛК и ТК повышено по сравнению с интактными мышами. Отмечается диффузное свечение гистамина во всех видах клеток. В гемопоэтических клетках светятся в основном ядра за исключением бластных форм, у которых люминесцируют периферические части цитоплазмы. Ярче клеток светится межклеточное вещество. Число гранулярных люминесцирующих клеток повышено в 2 раза. Свечение ГЛК яркое, много разнокалиберных гранул. Много гистамина в цитоплазме базофильных мегакариоцитов.
Люминесцирует только один вид мелких тучных клеток – с ассиметрично расположенными, как бы выпирающими, зелеными ядрами. Свечение тучных клеток совпадает с уровнем люминесценции межклеточного вещества.
Повышается дегрануляция тучных клеток и выход нейроаминов из гранул ГЛК в межклеточное пространство. Тем самым в межклеточном пространстве оказываются диамины, которые оказывают соответствующее влияние на гемопоэтические клетки костного мозга.
Отмечалось повышение числа размножающихся зрелых форм с увеличением некоторых биоаминов в них, что указывало на активацию иммунных реакций. Увеличивалось число митозов во всех клетках, образовывались шаровидные скопления морфологически одинаковых клеток, по периферии которых располагались ГЛК. Развивалось гомеобластическое кроветворение. Таким образом, при аутотрансплантации происходит стимуляция клеток-продуцентов.
При аллопересадке костного мозга, наоборот, снижалось число ГЛК и ТК, с пониженным содержанием в них КА и СТ, наблюдалась диффузия препарата. Нервные волокна не выявлялись. При исследовании на гистамин наблюдали в некоторых местах резкое снижение диффузного свечения межклеточных пространств и всех основных видов клеток, в других областях происходило усиление люминесценции межклеточных пространств.
Люминесцировали клетки эритроидного ряда, лимфоциты и ядра плазмоцитов. Выявлялись мегакариоциты, у которых содержание всех исследованных веществ было несколько повышено.
ГЛК люминесцировали темно оранжевым цветом и выявлялись в небольшом числе, полноценных клеток с хорошо заметными разнокалиберными гранулами было 1 – 2 на весь препарат, однако обнаруживались клетки, у которых люминесцировали 2 – 3 гранулы, размерами 0,05 мкм. Таких клеток было до 2 – 3 на одно поле зрения. Произошло резкое снижение числа клеток – регуляторов и числа гранул в них.
Такая же картина наблюдалась и с тучными клетками, иногда вместо клеток выявляются темно-оранжевые тени с расположенными рядом гранулами, размерами 0,005 мкм. Произошел тотальный распад этих клеток. Такие клетки не содержали свободного гистамина, он был чем-то связан.
Аллогенная пересадка, очевидно, вызывает супрессию синтеза биогенных аминов и распад клеток-регуляторов.
Вначале выявлялись митотически делящиеся группы клеток. Далее митотическая активность резко снижалась.
Таким образом, аллотрансплантация костного мозга сопровождалась распадом клеток-регуляторов, нарушенным синтезом нейроаминов, нарушением межклеточных регуляций иммунологических и кроветворных органов.
При исследовании содержания гепарина при аутотрансплантации костного мозга было выявлено, что выявлялась высокосульфатированность гепарина в части ТК. Возможно, гепарин стимулирует миграцию стволовых клеток из костного мозга и подавляет иммунные реакции путем предотвращения взаимодействия Т- и В-лимфоцитов. Гепарину медиатору тучных клеток, большинство исследователей (Новицкая С.А. и др., 1975), отводят локальную роль в модуляции клеточных ответов при иммунных процессах, блокирует трансформацию Т-лимфоцитов, предупреждает отторжение, увеличивает жизнь трансплантанта. В выработке его принимают участие тучные клетки.
В миелограмме выявляются митотически делящиеся лимфоциты, так и бластные формы.
Активность ферментов МАО, КФ была повышена вследствие развивалось усиление окислительно-восстановительных процессов.
При исследовании содержания нероспецифической енолазы в ТК и ГЛК отмечено ее увеличение. Произошло увеличение выявляемости клеток, принадлежащих к АПУД-системе.
При аллотрансплантации при изучении содержания гепарина отмечено, что встречаются поля из равномерных гранул, принадлежавших тучным клеткам. Клетки тотально распадаются, т.е. дегранулируют.
В миелограмме отмечено увеличение числа бластных форм клеток, а также клеток эритроидного ряда. Содержание зрелых лейкоцитоврезко снизилось. Все это говорит о том, что возможно произошел выброс зрелых форм клеток в кровяное русло. За счет этого идет митотическое деление бластных форм клеток.
При исследовании содержания МАО отмечено увеличение в ТК и ГЛК, при реакции на КФ, этот фермент обнаруживается в моноцитах, сегментоядерных нейтрофилах. Все это свидетельствует об активации процессов утилизации излишков нейроаминов и возможно, гибнущих клеток.
Сравнивая итоги экспериментов по ауто- и алло- ТКМ можно заключить, что пересадки костного мозга существенно влияют на нейроамины в костном мозге. Причем при алло- ТКМ изменения более выражены, чем при ауто- ТКМ, развивается большая супрессия нейроаминов.
Выводы:
1. Разные пересадки костного мозга, по-разному влияют на содержание нейромедиаторов в самих биоаминосодержащих структурах костного мозга.
2. При аутотрансплантации активируются процессы стимуляции клеток-регуляторов, функционирование биоаминосодержащих структур не нарушается. Кроме того, между нейроаминами по ГЛК и ТК существует как внутриорнанная, и так и межорганная связь. При аллопересадке эта связь разрушается. При аллотрансплантации с начала эксперимента развивается сдерживание выделения нейромедиаторов биоаминосодержащими структурами костного мозга, а в последующем наблюдается распад ГЛК и ТК.
3. Разные виды пересадок костного мозга по-разному влияют на степень сульфатации гепарина и функционирование ферментов, изменяют миелограмму.