Одной из острых проблем здравоохранения является лечение осложнений переломов костей. Несмотря на современные достижения в травматологии и ортопедии доля неудовлетворительных результатов лечения переломов, обусловленных замедленной консолидацией и несовершенным остеогенезом костной ткани, остается довольно высокой от 5 до 40 %. [4].
В экспериментах и клинических условиях доказано участие клеток иммунной системы, в частности нейтрофилов и моноцитов (макрофагов), в воспалительной и регенераторной фазах репаративного остеогенеза [3].
Однако, несмотря на проведенные исследования, значение факторов врожденного иммунитета остается не до конца изученным.
Цель исследования – изучить показатели врожденного иммунитета у пациентов с замедленной консолидацией костной ткани через 7 – 18 месяцев после закрытой травмы длинных трубчатых костей.
Материалы и методы исследования
Обследовано 39 пациентов через 7 – 18 месяцев после закрытых переломов длинных трубчатых костей, которые были разделены на две группы: основную и контрольную. Основная группа включала 19 пациентов в возрасте 41,8±3,4 лет, поступивших на лечение с последствиями закрытых переломов верхних и нижних конечностей (бедра – 9, голени – 8, плеча – 2): 10 мужчин и 9 женщин. Из них 8 пациентов до поступления лечились с использованием внутренней фиксации (накостный остеосинтез – 5 больных, интрамедуллярный блокируемый стержень – 3 больных), а 11 – с применением внешнего остеосинтеза. Причины нарушений консолидации были следующими: при внешней фиксации – неправильно выбранная схема остеосинтеза, отсутствие точной репозиции и раннее снятие аппарата. При использовании накостного остеосинтеза в двух случаях отмечали неправильный выбор типа или размера металлофиксатора, что не создавало прочной фиксации, в трех – перелом пластины или винтов. С блокируемым интрамедуллярным стержнем поступило на лечение трое больных с тяжелыми оскольчатыми переломами, в результате чего даже в условиях стабильной фиксации осколки не были адаптированы к своему ложу, вследствие чего формировался краевой дефект и сохранялся диастаз между основными фрагментами.
В контрольной группе использованы иммунологические показатели 20 пациентов аналогичного возраста с закрытыми переломами верхних и нижних конечностей, пролеченных в РНЦ ВТО по разработанным методикам с соблюдением всех методических принципов чрескостного остеосинтеза, у которых в обычные сроки было достигнуто сращение костных отломков в правильном положении.
В исследование не включались пациенты с сопутствующей соматической патологией, способной повлиять на результаты иммунологического исследования.
Для изучения фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) применялась стандартная методика, основанная на количественном определении поглотительной и переваривающей способности нейтрофилов по отношению к микробной тест – культуре (Staphylococcus epidermidis штамм № 9198 НИИЭМ). Рассчитывались следующие показатели ФАН: фагоцитарный показатель (ФП, %), фагоцитарное число (ФЧ, %). Кислородзависимую метаболическую активность нейтрофильных гранулоцитов оценивали в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ – тест) по методу Park, в двух вариантах: спонтанном и стимулированном. Лизосомальную активность нейтрофилов определяли, используя цитохимическое исследование клеток. Активность миелопероксидазы (МП) определялась по Грехему – Кнолю. Уровень лизосомальных катионных белков (КБ) цитоплазмы устанавливали в реакции с бромфеноловым синим. Уровень МП и КБ выражали в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Для подсчета нейтрофильных ловушек (НВЛ) использовали мазки крови, окрашенные по Романовскому – Гимза. Учет ФАН производился при помощи световой микроскопии под иммерсией, исходя из 100 подсчитанных нейтрофилов.
Определение содержания СD14+HLA-DR, характеризующих экспрессию HLA-DR на моноцитах, идентифицировали с помощью моноклональных антител компании «Immunotech» (Франция) методом лазерной проточной цитометрии на цитометре «BECKMAN COULTER EPICS XL» (США).
Все лица, участвовавшие в исследовании, дали информированное добровольное согласие на медицинское вмешательство и публикацию данных, полученных в результате исследования, без идентификации личности.
Анализ результатов исследования проводили с помощью программного обеспечения AtteStat, выполненного как надстройка к «Microsoft Exсel» программного продукта «Microsoft Office». Полученные данные обрабатывались с помощью методов непараметрической статистики с использованием U – критериев Вилкоксона, Манна – Уитни. Результаты исследования представлены в виде медиан и интерквартильных размахов (25 и 75 процентили).
Результаты исследования и их обсуждение
По данным литературных источников, нейтрофилы наряду с другими клетками иммунной системы, не только обеспечивают иммунную реактивность организма, но и играют большую роль в обеспечении репаративных процессов. Нейтрофилы оказывают влияние на коллагеногенез и ремоделирование внеклеточного матрикса путем продукции факторов, активирующих фибробласты [1].
Согласно результатам наших исследований, эффекторные свойства нейтрофильных фагоцитов (ФЧ) у пациентов с нарушением остеогенеза не отличались от контрольных (таблица). При этом активность фагоцитоза (ФП) достоверно превышала значения контрольной группы.
Показатели врождённого иммунитета в сроки от 1,5 до 2 лет после травмы
|
Показатель |
Замедленная консолидация костной ткани |
Сращение перелома в оптимальные сроки |
|
Нейтрофилы (109/л) |
3,75 (3,6 – 4,31) |
3,66 (3,24 – 3,81) |
|
Фагоцитарный показатель ( %) |
↑91,0* (88,3 – 94,8) |
87,5 (85,3 – 90,0) |
|
Фагоцитарное число (у.е) |
9,5 (8,0 – 13,8) |
9,0 (8,0 – 9,0) |
|
МП (СЦК) |
↑2,3* (2,0 – 2,5) |
2,0 (1,9 – 2,2) |
|
КБ (СЦК) |
↑2,3* (2,2 – 2,5) |
2,1 (2,0 – 2,2) |
|
НСТсп. ( %) |
↑9,0* (6,0 – 15,0) |
4,5 (4,0 – 5,0) |
|
НСТ стим. ( %) |
↑75,5* (69,0 – 80,0) |
67,5 (58,3 – 72,0) |
|
НВЛ ( %) |
↑3,0* (2,0 – 3,5) |
1,0 (0 – 1,0) |
|
Моноциты (109/л) |
↑0,64* (0,53 – 0,72) |
0,52 (0,45 – 0,67) |
|
СD14+HLA-DR ( %) |
↓84,0* (81,6 – 86,8) |
88,2 (85,9 – 90,3) |
Примечание. * – р≤0,05 в сравнении с показателями пациентов у которых сращение было достигнуто в оптимальные сроки.
Вместе с тем, у пациентов с несовершенным остеогенезом наблюдалось повышение лизосомальной киллинговой активности нейтрофилов – содержание МП и КБ было достоверно выше, чем у пациентов с благоприятным исходом лечения.
Одним из аспектов регуляции костеобразования является активация кислородзависимого метаболизма в травмированных тканях [6].
На этом фоне вполне закономерно усиление продукции активных форм кислорода (АФК) клетками организма, в частности нейтрофилами. Увеличение интенсивности кислородзависимых метаболических процессов при нарушении остеогенеза было выявлено в НСТ – тесте, который был достоверно выше, чем у пациентов с благоприятным исходом лечения. Значения HCT-стимулированного, позволяющего оценить функциональный резерв кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов, также были выше значений контроля.
Свои бактерицидные и цитотоксические функции нейтрофилы могут осуществлять путем классического фагоцитоза, но не меньшее значение для поддержания гомеостаза имеет и внешний киллинг – это недавно открытая (2004 г.) способность нейтрофилов образовывать сетеподобные структуры путем выброса во внеклеточное пространство нитей ДНК. Процесс формирования нейтрофилами внеклеточных ловушек является функцией альтернативной фагоцитозу, а возможно и более эффективной. Данный механизм внешней фагоцитарной активности нейтрофилов был до недавнего времени неизвестен и мало изучен, особенно у больных ортопедотравматологического профиля. Известно, что интенсивность образования НВЛ напрямую зависит от активности АФК и связана с величиной НСТ – теста [2].
Наши исследования показали достоверное увеличение количества нейтрофильных ловушек у больных с несросшимися переломами по сравнению с контролем.
В литературных источниках имеются указания на то, что моноциты также участвуют в регенерации костной ткани [5]. У пациентов с нарушениями остеогенеза нами было выявлено достоверное повышение абсолютного количества моноцитов, при этом экспрессии HLA-DR на моноцитах была достоверно ниже, чем в контрольной группе. Известно, что экспрессия HLA-DR на моноцитах – надежный маркер дисфункции моноцитов, связанной с увеличением риска инфекционных осложнений при таких патологических состояниях как острая травма, серьёзные ожоги, острый панкреатит обширные хирургические вмешательства [6, 7].
Литературные сведения об экспрессии HLA-DR на моноцитах в условиях замедленной консолидации костной ткани в доступных литературных источниках отсутствуют. Полученные нами данные свидетельствует об умеренном снижении способности моноцитов выполнять свою антигенпредставляющую функцию в группе с замедленной консолидацией костной ткани.
Заключение
Таким образом, при нормальной репаративной активности костной ткани через 7 – 18 месяцев после травмы основные показатели врождённого иммунитета находятся в пределах границ физиологической нормы. Замедленная консолидация костной ткани, обусловленная отсутствием стабильной фиксации, характеризуется умеренным сниженнием способности моноцитов экспрессировать на своей поверхности HLADR, усилением кислородзависимой и кислороднезависимой бактерицидной активности нейтрофилов и способности нейтрофилов к формированию нейтрофильных внеклеточных ловушек. Наблюдаемые нами иммунологические нарушения у больных с нарушениями консолидации являются, на наш взгляд, вторичными и обусловлены сохраняющейся подвижностью костных отломков, нестабильностью металлоконструкций и отсутствием полноценного контакта костных отломков, металлозом, пролонгированным некрозом интерпонированных тканей.