Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Изучению белкового состава сыворотки крови при различных патологических процессах, в том числе и при остеомиелите, посвящены многочисленные исследования. Изменение спектра сывороточных белков у больных остеомиелитом выражается в виде гипо- и диспротеинемии, уменьшении удельного веса альбуминов и возрастании относительного содержания глобулинов [11]. При этом выраженность патохимических проявлений остеомиелитического процесса на организменном уровне зависит не только от обширности повреждения, реактивности организма, стадии болезни, но и свойств микробов, заселяющих очаг воспаления [4].

В последнее время в патогенезе хронического остеомиелита большое значение уделяется роли бактериальных биопленок [12]. Свойства бактерий в биопленках отличаются от таковых у изолированных клеток, что оказывает влияние на взаимодействия микроба с организмом человека, в том числе и факторы иммунной защиты. С особенностями выживания бактерий в биопленках в значительной степени связана хронизация инфекции, переход микробов к длительной персистенции и неэффективность антимикробной терапии [7]. В связи с чем, интерес представляет изучение характера белкового спектра и, главным образом, количественных изменений глобулинов, свидетельствующих о напряженности антибактериального иммунитета [8] в зависимости от способности микроорганизмов к биопленкообразованию.

Цель нашего исследования – провести сравнительный анализ количественных показателей белкового состава сыворотки крови и уровня биопленкообразования клинических штаммов бактерий, выделенных из ран пациентов с хроническим остеомиелитом длинных трубчатых костей.

Материалы и методы исследования

В работе представлены результаты однократного исследования фракционного состава белков сыворотки крови, выполненного перед оперативным вмешательством, и способности к биопленкообразованию клинических штаммов, выделенных из свищей в дооперационном периоде или из очага воспаления во время оперативного вмешательства у 14 пациентов с хроническим остеомиелитом длинных трубчатых костей. В группу исследования были включены 5 мужчин и 9 женщин в возрасте от 22 до 66 лет (средний возраст составил 60,5 лет (40,8 лет; 65,0 лет)).

Электрофоретическое разделение и идентификацию фракций белков сыворотки крови проводили с помощью автоматического электрофоретического анализатора SAS-1plus, автоматической системы обработки гелей SAS-2 (Helena Biosciences Europe, Великобритания) и программного обеспечения Platinum III. Общий белок (ОБ) сыворотки крови определяли с использованием автоматического биохимического анализатора HITACHI 902 (США) и реагентов фирмы «VitalDiagnostics» (Россия). В качестве контрольных значений использовали данные литературы [10].

Выделение чистой культуры штаммов проведено общепринятыми методами. Идентификация исследуемых штаммов выполнена на бактериологическом анализаторе WalkAway-40 Plus («Siemens», США).

Способность клинических штаммов формировать биопленки на поверхности 96-луночных полистироловых планшетов определяли по методу G.OʼToole и R. Kolter [13] с некоторыми изменениями в собственной модификации. Суточную бульонную культуру приводили к стандарту мутности 0,2 по McFarland стерильным мясо-пептонным бульоном (МПБ), что соответствовало 108 КОЕ/мл. В лунки планшета осторожно наливали по 200 мкл полученной микробной взвеси исследуемого штамма в 4 повторах с последующей инкубацией в термостате при 37˚С. В качестве отрицательного контроля служили лунки со стерильным МПБ. Через 48 часов жидкую фазу из лунок осторожно удаляли, образовавшуюся на их поверхности биопленку трехкратно промывали 1,15М фосфатным буфером и окрашивали раствором генциан-виолета в течение 45 минут при комнатной температуре, после чего лунки трехкратно промывали фосфатным буфером. Для эстрагирования красителя вносили в лунки по 200 мкл этанола и инкубировали при комнатной температуре 45 минут. Затем измеряли оптическую плотность (ОП) на фотометре ELx808 (BioTek, США) при длине волны 630 нм. Анализировали средние значения четырехкратных измерений. При значениях ОП˂0,090 считали, что штаммы не обладали способностью к образованию биопленки; при значениях 0,090<ОП≤0,180 – расценивали как низкую; при 0,180<ОП≤0,360 – как среднюю и при ОП ˃0,360 – как высокую способность к пленкообразованию.

Для оценки зависимости фракционного состава белков сыворотки крови от способности штаммов к биопленкообразованию определяли коэффициент Кендалла, критерии которого оценивали по шкале Чеддока: 0,1<rxy <0,3 – слабая; 0,3<rxy<0,5 – умеренная; 0,5<rxy<0,7 – заметная; 0,7<rxy<0,9 – высокая; 0,9<rxy<1 – весьма высокая.

Статистическую обработку данных исследования выполняли с помощью табличного редактора «Microsoft Excel – 2010» и программного обеспечения анализа данных AtteStat Версия 13.0 [3]. Цифровые данные представлены в виде медианы, 25 % и 75 % квартилей (Me (Q25; Q75). Для оценки статистической значимости различий между группами использовали критерий Вилкоксона. Различия считали существенными при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе работы исследовали клинические штаммы, выделенные из ран в монокультуре. В 11 из 14 случаев это были стафилококки, в том числе Staphylococcus aureus (n=6) и коагулазоотрицательные стафилококки: S. epidermidis (n=2), Мethicillin-resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE) (n=2), S. hyicus (n=1). В одном случае был выделен представитель рода Pseudomonas – Pseudomonas aeruginosa, в двух – представитель семейства Streptococcaceae – Enterococcus faecalis.

Изучение биопленкообразующей способности клинических изолятов показало, что большая часть культур обладала способностью к образованию биопленок: 5 штаммов (S. aureus – 3, S. epidermidis – 1, E.faecalis – 1) – низкой и 5 штаммов (S. aureus – 2, S. epidermidis – 1, MRSE – 1, P. aeruginosa – 1) средней. У 4-х изолятов способность к образованию биопленки отсутствовала (S. aureus – 1, MRSE – 1, S. hyicus – 1, E.faecalis – 1). На основании чего для сравнения с данными электрофоретического исследования сывороточных белков пациенты были распределены на 3 группы: первая – пациенты, у которых выделенные из свищей штаммы не обладали способностью к образованию биопленки на поверхности полистирола; вторая – обладали низкой; третья – средней способностью к биопленкообразованию.

Содержание общего белка у пациентов соответствовало типу гипо- и диспротеинемии, что согласуется с данными литературы [11]. Необходимо отметить, что только у пациентов третьей группы, клинические штаммы которых обладали средней способностью к биопленкообразованию, общий белок находился в пределах нормы, а изменение содержания альбумина было связано главным образом с увеличением концентрации β- и γ–глобулинов.

Из 14 пациентов только у 1-го количество альбумина находилось в пределах нормы, приближаясь к ее нижней границе. У остальных пациентов снижение альбумина сопровождалось одновременным увеличением одной или нескольких фракций глобулинов: α1-глобулинов (n=1); α2-глобулинов (n=2); β-глобулинов (n=2); γ–глобулинов (n=1); α1 + β–глобулины (n=1); α2+ β-глобулинов (n=1); β + γ–глобулины (n=3); α1 + α2 + β-глобулинов (n=1); α1 + β + γ–глобулины (n=1).

Анализ результатов исследования белковых фракций сыворотки крови показал, что средние значения количества α1-глобулинов не выходили за границы контрольных показателей [10]. При этом у 4-х из 14-ти пациентов данный показатель был выше верхней границы нормы на 35-160 %. В первой группе, где бактерии не обладали способностью к образованию биопленки, концентрация α1-глобулинов у всех пациентов находилась в пределах нормы.

Увеличение концентрации α2-глобулинов на 14-21 % по сравнению с контрольными значениями отмечено у 4-х пациентов.

Среднее значение количества β-глобулинов было выше нормы вследствие увеличения данного показателя на 13-38 % у 9 пациентов, в том числе у четверых пациентов третьей группы.

Количество γ-глобулинов было повышено на 9-59 % по сравнению с нормой у 5 пациентов в том числе у трех из третьей группы. У всех пациентов первой группы данный показатель не выходил за границы контрольных значений [10].

Альбумино-глобулиновый коэффициент (А/Г) отличался от нормы у всех пациентов, что было связано со снижением количества альбуминов и сопутствующим ему нарастанием фракций глобулинов, при этом отмечалось статистически значимое снижение данного показателя во второй и третьей группах по сравнению с первой.

Сопоставление показателей белкового спектра сыворотки крови и различной способности клинических штаммов к биопленкообразованию представлено в табл. 1.

Таблица 1

Белковый состав крови пациентов с хроническим остеомиелитом в зависимости от способности штаммов к биопленкообразованию

Различия значимы по сравнению с 1 группой: * – р˂0,05; ** – р˂0,01.

Корреляционный анализ показал, что имеется заметная связь между

• %способностью штаммов к образованию биопленки и содержанием общего белка (r=0,56, р=0,005);

• %биопленкообразованием и концентрацией β-глобулинов (r=0,56, р=0,01) в сыворотке крови.

Высокая зависимость выявлена между содержанием γ–глобулинов и способностью клинических изолятов к биопленкообразованию (r=0,85, р=0,00003).

Этиология и патогенез хронического остеомиелита связаны с микробными биопленками, оказывающими влияние на рецедивирующее течение заболевания, хронизацию воспалительного процесса и резистентность к антимикробным препаратам [12].

Способность к образованию биопленки является основным фактором вирулентности микроорганизмов. Факторы вирулентности грамположительных и грамотрицательных бактерий, оказывающих прямое и опосредованное воздействие на организм человека, часто имеют схожие механизмы и результаты действия. Опосредованное действие микробов на организм человека проявляется в нарушениях работы систем и органов, возникающих за счет действия собственных молекул, прежде всего цитокинов, выработку которых индуцируют бактерии [7].

Увеличение локальной продукции цитокинов (IL 1β, 2, 6, 12, 17; TNFa) отмечено при экспериментальной биопленочной инфекции. При этом высокая концентрация цитокинов, с одной стороны, является причиной миграции лимфоцитов, с другой – следствием инфильтрации очага воспаления различными популяциями лейкоцитов [15].

При исследовании сыворотки крови у больных хроническим остеомиелитом также отмечалось достоверное повышение уровня цитокинов (IL 1β, 2, 4, 6, 10; TNFa) [6].

Одним из проявлений синдрома системного воспалительного ответа при различных заболеваниях инфекционной природы, в том числе и при остеомиелите, инициированного гаммой вновь синтезированных цитокинов (IL 1, 6, 8, TNFa и т.д.), является нарушение белкового состава крови [1].

При анализе протеинограмм в нашем исследовании обращает на себя внимание снижение количества общего белка, альбуминов и сопутствующее им увеличение глобулинов.

Считается, что изменение содержания общего белка плазмы крови и качественного состава его фракций не являются специфическими, а отражают общий патологический процесс, динамику и тяжесть заболевания. Вместе с тем известно, что хронические нарушения инфекционного происхождения ведут к гипопротеинемии, выражающейся прежде всего гипоальбунемией, а в случае ведущей роли инфекционного фактора и к фазным изменения в показателях глобулинов [8, 10].

Так, увеличение фракции α1-глобулинов наблюдается при острых и хронических воспалительных процессах. Один из основных компонентов данной фракции – α1-антитрипсин – ингибитр протеаз, источниками которых являются бактерии. При ифекционном воспалительном процессе происходит высвобождение протеаз из бактериальных клеток и лейкоцитов. При этом в отсутствие эффективных ингибиторов эти ферменты могут вызывать значительные повреждения тканей [8, 10].

Общая антитриптическая активность сыворотки определяется присутствием не только α1-антитрипсина, но и других ингибиторов трипсина, в том числе и α2-макроглобулина, который вместе с гаптоглобулином в основном и формирует фракцию α2-глобулинов. Макроглобулины представляют группу белков плазмы являющихся регуляторами иммуной системы, а также неспецифическими ингибиторами протеаз [8, 10].

Фракция β-глобулинов содержит компоненты комплемента, участвующие в реакциях иммунитета, и часть иммуноглобулинов. Ее повышение является показателем стимулирования защитных сил организма, так как белки системы комплемента, действуя в сочетании с иммуноглобулинами, опсонируют и лизируют чужеродные агенты [8, 10]. Именно комплемент – важнейшая гуморальная система врожденного иммунитета – может активироваться биопленками [9].

Увеличение содержания γ-глобулинов обусловлено повышенной продукцией иммуноглобулинов классов G, A, M, D, Е, представляющих собой антитела и обеспечивающих гуморальный иммунитет [8, 10]. Известно, что у больных хроническим остеомиелитом наблюдается выраженная гиперфункция В-гуморального иммунитета на фоне дефицита Т-клеточной системы иммунитета, что обусловлено длительной хронической интоксикацией организма из очага воспаления [2].

Заключение

В нашем исследовании мы обращали внимание на связь количественных отклонений белкового состава крови со способностью бактерий к биопленкообразованию. Полученные результаты свидетельствуют о различной способности микроорганизмов, участвующих в развитии гнойных осложнений при остеомиелите к образованию биопленки, что свидетельствует о различиях в их вирулентных свойствах [5]. При этом необходимо отметить, что отсутствие или низкая способность к биопленкообразованию бактерий при исследовании in vitro не исключает возможности проявления данного свойства в других условиях [14].

Установлено, что в белковой формуле сыворотки крови происходят определенные сдвиги: с увеличением способности бактерий к биопленкообразованию более выраженным оказывалось уменьшение концентрации альбумина и значимое повышение уровня γ-глобулинов. Содержание α1- и α2-глобулинов в большинстве случаев оставалось в пределах нормы. Не выявлено существенных изменений в содержании β-глобулинов, хотя наблюдается тенденция к их росту с увеличением способности бактерий к биопленкообразованию. Обнаружение ряда значимых корреляционных связей может свидетельствовать о том, что показатели белкового состава сыворотки крови отражают не только выраженность патологического процесса при хроническом остеомиелите, но и активность биопленочного воспаления.