Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки (ММСК), обладающие высокой биологической активностью и потенциалом дифференцировки, активно используют в развивающейся клеточной медицине [6]. Одним из наиболее доступных и перспективных типов стволовых клеток взрослого организма для аутологичной клеточной терапии считают ММСК жировой ткани (ММСК-ЖТ).
Результаты исследований в области регенеративной физиотерапии свидетельствуют о возможности комплексного использования стволовых клеток и различных физических факторов с целью ускорения регенерации поврежденных тканей [2, 3]. Среди наиболее часто применяемых факторов в лечении костно-суставной патологии следует отметить импульсное магнитное поле (ИМП), механизмы действия которого нельзя считать до конца изученными [8, 9, 10]. Последние десятилетия в физиотерапевтической практике успешно используют и полихроматический некогерентный поляризованный свет, включающий видимый и инфракрасный диапазоны [1, 4, 5].
Однако большинство известных исследований по воздействию физических факторов на ММСК на модели in vitro проводилось с использованием временных интервалов, дозировок и аппаратуры, отличающихся от применяемых в стандартной физиотерапии, и пригодных, скорее, для экспериментальных исследований, чем для практической медицины [7].
Цель исследования: изучить воздействие бегущего импульсного магнитного поля и полихроматического некогерентного поляризованного света в терапевтических дозах с использованием стандартной аппаратуры («Алмаг», «Биоптрон»), применяемой в клинике, на морфологию, фенотипические характеристики, жизнеспособность, пролиферативную и секреторную активность ММСК-ЖТ в культуре.
Материалы и методы исследования
Работа проводилась на 7 штаммах культур ММСК – ЖТ. Источником материала была жировая ткань семи пациентов, лечившихся в отделении микрохирургии, у которых её забирали в объеме 1-2 мл во время реконструктивных операций.
Каждый пациент дал информированное согласие на участие в научном исследовании, протокол которого утвержден комитетом по Этике и ученым советом ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России.
Клетки выделялись с помощью тепловой ферментативной обработки коллагеназой (ООО «ПанЭко, Москва) в течение часа при 37С ° и культивировались в среде α – MEM с добавлением 20 % телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС), глутамина, антибиотиков (пенициллин/стрептомицин) при абсолютной влажности, 37С °, 5 % СО2. Использовали среды и реактивы фирмы ООО«ПанЭко», Москва, Россия. По достижении 50 % субконфлюэнтного монослоя культуру пересевали. В экспериментах использовали культуру 3–4 пассажа. Клетки засевали с плотностью 5тыс/см² на восемь флаконов (Costar) площадью 25 см².
Перед началом эксперимента определяли фенотип клеток на цитофлюориметре «Becman Coulter», используя моноклональные антитела CD 45 PC 5, CD 14 PC5, CD HLA-DR PC7, CD 34 PC7, CD 90 Fitc, CD 105 PE, CD 44 Fitc, CD 73 PE, CD 10 PC7, CD 13 PC5 с соответствующими изотипическими контролями.
Культуру в трех флаконах подвергали однократному воздействию различными физическими факторами в терапевтических дозах. На клетки в первом флаконе воздействовали трижды в терапевтической дозе с интервалом 24 часа ежедневно. Контролем служила интактная культура, флаконы с которой на время воздействия извлекались из инкубатора. В течение всего эксперимента смены среды не проводили.
Наблюдение за состоянием культуры в процессе роста и видеоархивирование проводили с помощью инвертированного микроскопа «Leica DM IL», оснащенного видеокамерой и программой «Leica IM 1000», при увеличении 50х, 100х, 200х перед началом воздействия и через 24, 48 и 72 часа после него. В эти же периоды определяли плотность клеток на единицу площади культурального сосуда, жизнеспособность клеток, отбирали и замораживали пробы ростовой среды для последующего определения протеинов и факторов роста.
При исследовании трехкратного воздействия фиксацию результатов и отбор проб проводили через 24 часа после последнего. По окончании эксперимента определяли фенотип клеток в культуре. Для исследования секреторной активности клеток культуры определяли уровень одного из основных протеинов межклеточного матрикса – фибронектина, трансформирующего фактора роста TGF-β, интерлейкинов ИЛ – 6, ИЛ – 10.
Определение фибронектина, интерлейкинов и фактора роста проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя наборы реагентов группы компаний ВСМ «Биохиммак». Величину оптической плотности регистрировали на анализаторе «Sunrise» (Австрия) с использованием программы «Magellan», которая в автоматическом режиме позволяет строить калибровочную кривую и определять концентрацию исследуемых веществ.
Источником бегущего импульсного магнитного поля (БИМП) был аппарат «Алмаг-01». Воздействие осуществляли в терапевтической дозировке, согласно инструкции, у пациентов с патологией кисти (величина магнитной индукции (20±6) мТл, длительность импульса – 1,5–2,5 мс, частота следования импульсов МП в каждой из катушек – 6Гц, частота волн БИМП – 1,5 гц, время воздействия – 10 минут).
Второй исследуемый фактор – полихроматический некогерентный поляризованный свет от аппарата «Биоптрон компакт III» (Швейцария) удельной мощностью 40 мВт/см², с плотностью потока световой энергии 2,4 Дж/см² в минуту. Воздействие осуществляли с расстояния 10 см в течение 6 минут.
Результаты исследования и их обсуждение
В процессе наблюдения за ростом культуры при сравнении состояния монослоя и формирующих его клеток в опытных и контрольных сериях, признаков изменения рисунка и плотности монослоя, нарушения адгезии клеток к поверхности пластика, признаков деградации, патологических изменений в цитоплазме и ядерных структурах зафиксировано не было. Детрита практически не определялось, клетки были правильной формы с четкими контурами, выраженными отростками, плотными ядрами, в которых фиксировалось 2-4 ядрышка. Резких изменений ph среды не отмечено.
Таким образом, признаков цитотоксического воздействия исследуемых факторов на клетки в культуре не выявлено.
Фенотип клеток всех культур был типичным для мезенхимных стволовых клеток, на них в 98–99 % определялись CD 90+, CD 105+, CD 44+, CD 73+, CD 10+, CD 13 + и не фиксировались маркеры гемопоэтических клеток CD 45, CD 14, CD HLA-DR, CD 34.
По окончании эксперимента (через 72 часа после воздействия) повторяли исследование, которое продемонстрировало отсутствие изменения экспрессии на клетках исследуемых культур. На них в 98-99 % случаев определялись маркеры мезенхимных клеток и не фиксировались маркеры гемопоэтических клеток.
Таблица 1
Изменение плотности клеток на 1см2 площади в процессе роста культуры после воздействия физических факторов
|
Группы |
Период после воздействия |
|||
|
24 ч |
48 ч |
72 ч |
через 24 ч после 3-х кратного воздействия |
|
|
Опыт (воздействие БИМП) |
6388,75 ± 840,06 |
7310,78 ± 1123,41 |
8233,56 ± 1499,28 |
8092,6 ± 1397,42 |
|
Опыт (воздействие полихроматическим некогерентным поляризованным светом) |
6755,5 ± 904,15 |
7646,18 ± 1400,17 |
11990,56 ± 3696,22 |
11534,25 ± 3442,41 |
|
Контроль |
6535,26 ± 547,78 |
7227,92 ± 684,38 |
9544,12 ± 1637,83 |
9544,12 ± 1637,12 |
Таблица 2
Изменение уровня фибронектина в нг/мл в ростовой среде в процессе роста культуры после воздействия физических факторов
|
Группы |
Период после воздействия |
|||
|
24 ч |
48 ч |
72 ч |
через 24 ч после 3-х кратного воздействия |
|
|
Опыт (воздействие БИМП) |
820 ± 311,3 |
1115,1 ± 355,07 |
1463,8 ± 351,25 |
1275,4 ± 313,38 |
|
Опыт (воздействие полихроматическим некогерентным поляризованным светом) |
435,04 ± 137,56 |
777,3 ± 216,02 |
937,04 ± 248,67 |
1006,56 ± 313,36 |
|
Контроль |
653,81 ± 181,01 |
1011,44 ± 203,39 |
1274,2 ± 229,07 |
1274,2 ± 229,07 |
Жизнеспособность клеток в опытных и контрольных сериях не отличалась и составляла не менее 98–99 %. Плотность клеток в процессе роста равномерно нарастала в течение всего времени наблюдения и достоверно не отличалась в опытных и контрольных сериях (табл. 1).
При определении уровня одного из основных белков внеклеточного матрикса – фибронектина отмечено равномерное накопление его в ростовой среде, начиная с третьих суток наблюдения, как в опытных, так и в контрольных сериях, без достоверных отличий между сериями (табл. 2).
Уровень цитокинов ИЛ-6, ИЛ-10 и TNF-β также достоверно не отличался в опытных и контрольных сериях в течение всего периода наблюдения.
Таким образом, как однократное, так и трехкратное воздействие БИМП и полихроматическим некогерентным поляризованным светом в терапевтических дозировках не оказывает цитотоксического эффекта на морфологию ММСК-ЖТ, не влияет на иммунофенотип клеток культуры, жизнеспособность, пролиферативную и секреторную активность клеток в системе in vitro.
Однако существует мнение, что физические факторы влияют на процессы регенерации и восстановления физиологических функций тканей в основном опосредованно, через воздействие на обмен веществ, состояние нервной и эндокринной систем, энергетические процессы и интенсивность кровообращения в поврежденных органах, а также активность и выработку гуморальных и тканевых регуляторов, так называемых факторов роста [3].
Заключение
Так как клетки мезенхимного ряда являются активными продуцентами цитокинов и факторов роста, обеспечивающих аутокринную и паракринную регуляцию, можно предположить, что результаты влияния тех или иных воздействий могут проявляться в системе in vitro в более поздние сроки или на следующих клеточных популяциях. Поэтому для оценки влияния физических факторов на жизнедеятельность ММСК на модели in vitro необходимы дальнейшие исследования.