Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,564

STEREOULTRASTRUCTURAL SYUDY OF BACTERIAL BIOFILMS OF INFECTED NIDUS IN PATIENTS WIT CHRONIC OSTEOMYELITIS

Ocheretina R.Y. 1 Naumenko Z.S. 1
1 Scientific and clinical laboratory of microbiology and immunology Federal State Budgetary Institution Russian Ilizarov Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopaedics Ministry of Health of the Russian Federation
1969 KB
Bacterial biofilms of P. aeruginosa, S. aureus strains and mixture cultures obtained in vitro from the same strains isolated in patients with chronic osteomyelitis were morphologically studied using scanning electronic microscope. The bacteria were incubated during 24 hours in liquid nutrient medium (GRM-agar) on polystyrene plates, fixed in mixture paraformaldehyde and glutaraldehyde solution with phosphate buffer pH 7.4, washed, dewatered, soaked in camphene and dried out. P. aeruginosa strains were shown to have high biofilm formation characteristics. Mixture cultures (P. aeruginosa + S. aureus) showed bacilli prevailing over cocci. Pseudomonas and Staphylococcus strains formed bacterial film with evident specific differences in vitro after 24 hours of incubation on polystyrene plates, whereas mixture cultures (P. aeruginosa + S. aureus) showed three-dimensional biofilm.
biofilm
P. aeruginosa
S. aureus
scanning electronic microscopy

Хронический посттравматический остеомиелит продолжает оставаться актуальной медико-биологической и социальной проблемой. По данным современных исследований установлено, что при хронических формах заболеваний микробной этиологиив в организме формируются биопленка [1, 2]. Наиболее часто выделяемыми возбудителями у больных хроническим остеомиелитом являются Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Формирование биопленок с участием этих микроорганизмов может играть решающую роль в патогенезе остеомиелита. Подавляющее большинство исследований относится к изучению моновидовых биопленок, с использованием светового микроскопа и/или спектрофотометра. Вопросы структурно-функциональных особенностей моновидовых биопленок и межмикробного взаимодействия в многовидовых биопленках остаются недостаточно изученными. Сканирующая электронная микроскопия, в отличие от традиционных методов исследования биопленок, позволяет использовать более широкий диапазон увеличений, исследовать рельеф объекта, а не только клетки поверхностного слоя [3, 4].

Цель исследования – определить морфологические особенности биопленки бактерий, выделенных у пациентов с хроническим остеомиелитом, с помощью сканирующего электронного микроскопа.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили микроорганизмы, выделенные из зоны повреждения кости пациентов с хроническим гнойно-воспалительным процессом в кости, проходивших лечение в «Российском научном центре «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова». В исследование были включены штаммы P. aeruginosa, S. aureus и смешанная культура, полученная in vitro из этих же штаммов. Видовая принадлежность штаммов установлена с использованием бактериологического анализатора и микротест систем фирмы «BioMerieux» (Франция). Биопленку получали культивированием бактерий на подложке стерилизованной полистироловой ячейки блистерной упаковки диаметром 3 мм с перфорациями по всему диаметру, погруженной в суспензию микроорганизмов в жидкой питательной среде (ГРМ-агар) в течение суток [5]. После культивирования образец с микроорганизмами на подложке упаковки фиксировали в смеси 2 %-х растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением 0,1 % пикриновой кислоты при температуре 4 °С. Затем промывали в фосфатном буфере и дистиллированной воде, используя фильтровальную бумагу для удаления раствора через отверстия в ячейке. Обезвоживали в этиловом спирте возрастающей концентрации, пропитывали в камфене (С10Н16) при температуре 60 °С. Далее образцы высушивали на воздухе до полной возгонки камфена при комнатной температуре [5]. Монтировали ячейки с бактериями на держатель образца. Затем напыляли серебром в ионном напылителе «IB-6» (JEOL, Япония) и изучали в сканирующем электронном микроскопе «JSM-840» (JEOL, Япония) при инструментальном увеличении 2500-10000 во вторичных электронах с ускоряющим напряжением 20 keV.

Результаты исследования и их обсуждение

Через 24 ч. культивирования выявлены микроорганизмы палочковидной (P. aeruginosa) и кокковидной формы (S. aureus), объединенные секретированными ими полимерами и адгезированными к поверхности ячейки (рис. 1).

Клетки Staphylococcus располагались отдельными группами в форме неправильных скоплений (по 4–30 клеток), в том числе напоминающих виноградную гроздь, однослойных цепочек, и редко, одиночных клеток (рисунок, а). Отмечен тесный непосредственный контакт между клетками. Обнаружены единичные двухслойные скопления клеток, объединенные матриксом. Отмечены участки ячейки свободные от бактерий.

och1a.tif och1b.tif

och1c.tif och1d.tif

Сканограммы штаммов P. aeruginosa и S. aureus выделенных из зоны повреждения кости у пациентов с хроническим остеомиелитом. а) S – одиночные клетки S. aureus, В – скопление клеток S. aureus «виноградная гроздь», Ц – скопление клеток S. aureus в виде цепочки, П – поверхность ячейки, увеличение 2500; б) Р – P. aeruginosa, М – матрикс, П – поверхность ячейки, увеличение 3000; в) П – перетяжка, Пд – перетяжка делящейся клетки P.aeruginosa, Пдд – перетяжка поделившейся клетки P. Аeruginosa, увеличение 10000; г) S – S. aureus, Р – P. aeruginosa, М – матрикс, увеличение 5000. Фиксация в смеси растворов параформальдегида и глутаральдегида на фосфатном буфере (рН 7,4)

Клетки P. аeruginosa располагались под различным углом относительно друг друга, образуя сплошной монослой из палочковидных клеток, погруженных в матрикс (рисунок, б). Между клетками выявлены как непосредственные контакты, так и матрикс – опосредованные взаимосвязи. При инструментальном увеличении 10000 выявлены отдельные клетки, которые соединялись между собой перетяжками из структур матрикса, связывающие бактерии друг с другом (рисунок, в). Выявлены P. aeruginosa, различные по форме и размеру, а также овальные мелкие клетки, соединенные перетяжкой, характерной для делящихся бинарным путем палочковидных бактерий.

В смешанной культуре P. aeruginosa + S. aureus отмечено количественное преобладание палочковидных форм над кокковидными (рисунок, г). Обнаружена трехмерная структура, состоящая из нескольких слоев микробных клеток. Палочковидные бактерии, адгезированные к поверхности ячейки, погруженные в матрикс, располагались монослоем. На поверхности этого монослоя выявлены отдельно расположенные клетки P. aeruginosa и группы клеток S. aureus с преобладанием последних.

Обсуждение полученных данных. Анализ полученных данных позволил выявить морфологические особенности ранних моновидовых биопленок золотистого стафилококка и синегнойной палочки из остеомиелитического очага у пациентов с хроническим гнойно-воспалительным процессом. Отмеченное преобладание палочковидных форм на этапе адгезии микроорганизмов к субстрату позволяет предположить, что в условиях in vitro адгезия планктонных форм к поверхности полистироловой ячейки блистерной упаковки более выражена у штамма P. aeruginosa. Аналогичные данные были получены при исследовании биопленкообразующей способности этого возбудителя другими методами [6].

В смешанной культуре (P. Aeruginosa + S. aureus) выявленное в биопленке преобладание P. aeruginosa, формирующих монослой, вероятно, обусловлено высокими пленкообразующими свойствами штаммов рода Pseudomonas. В практической медицине при многократном исследовании пациентов традиционными бактериологическими методами нередко отмечается смена одного возбудителя другим. У больных хроническим остеомиелитом известны факты выделения S. aureus при первом заборе материала и P. aeruginosa (или ассоциация бактерий) – при повторном заборе [7]. Формирование трехмерной структуры смешанной бактериальной культурой свидетельствует об активизации процесса пленкообразования бактериями. Межвидовые взаимосвязи в биопленках, образованных различными видами бактерий, требуют дальнейшего изучения. По нашему мнению, в лабораторной практике при проведении исследования бактериальной инфекции у пациентов с хроническим остеомиелитом необходимо учитывать особенности начальных этапов формирования биопленки и межвидовые взаимоотношения микробиоценоза в смешанной культуре.

Таким образом, штаммы родов Pseudomonas и Staphylococcus, выделенные у пациентов с хроническим остеомиелитом, в условиях in vitro через 24 ч культивирования формируют бактериальную пленку на полистироловой поверхности с выраженными видовыми отличиями. Штаммы рода P. aeruginosa обладают высокими пленкообразующими свойствами. Смешанная культура (P. Aeruginosa + S. aureus) образует трехмерную структуру биопленки через 24 ч.