Злоупотребление алкоголем является одной из основных причин низкой продолжительности жизни в РФ. От трети до более половины смертей мужчин трудоспособного возраста составляют прямые и непрямые алкогольные потери [1, 2]. Помимо анализа социально-экономических и психологических факторов большое значение имеет исследование алкоголизма, позволяющее выявить молекулярные механизмы развития заболевания и нарушений, связанных с злоупотреблением алкоголем. В настоящее время во всем мире проводится исследование диагностических маркеров потребления алкоголя. Их используют при профессиональной диспансеризации, при возврате водительского удостоверения, изъятого по причине вождения в состоянии алкогольного опьянения, при наблюдении за ходом лечения больных алкоголизмом, при подготовке к хирургическому вмешательству. Наиболее специфичным и перспективным из таких маркеров для клинической практики является карбон-дефицитный трасферрин (CDТ) [3]. Среди существующих методик выявления граждан, страдающих хроническим алкоголизмом, наиболее распространенными являются способы позволяющие проводить анкетирование. К ним относятся тесты: CAGE, AUDIT, Сетка LeGo. Они просты для заполнения больными, легко и быстро оцениваются врачом, и в наибольшей мере учитывают национальные особенности « российского менталитета» и отношение к алкоголю [4, 5, 6].
Мировой опыт свидетельствует, что краткое анкетирование и элементарный врачебный осмотр являются качественным диагностическим инструментарием. Необходимо дополнительное использование тестов, которые повышают вероятность распознавания хронической алкогольной интоксикации (ХАИ). В первую очередь к ним относятся биохимические анализы, определяющие повышение активности гамма-глутамилтранспептидазы (GGT), аминотрансферазы [7]. В последние годы для объективной лабораторной диагностики хронической алкогольной интоксикации применяют качественное и количественное определение маркера карбогидрат-дефицитного трансферрина (CDT) в сыворотке крови больного [8].
Среди маркеров потребления алкоголя наиболее специфичным является карбондефицитный траснферрин. Трансферрин-белок, переносящий в клетки всех тканей тела ионы железа при их абсорбции в кишечнике или высвобождении из эритроцитов. Различие изоформ трасферрина определяется гликозилированием. Основная фракция трансферрина представлена изоформной с 4 остатками сиаловой кислоты. При потреблении значительных количеств алкоголя (40-60 г в день на протяжении нескольких дней, или больших разовых доз) возрастает доля карбонгидрат-дефицитного трансферрина (CDT) –изоформ с двумя, одним остатком или полностью десиализированный трансферрин (0-форма). В норме фракция CDT не превышает 1.3 % – 1.7 %, тогда как при потреблении указанных количеств алкоголя уровень CDT превышает эти границы и может возрастать до 10-15 раз. Выбор данного маркера основан на его диагностической возможности отражать как раннее и скрытое злоупотребление алкоголем, так и обеспечивать мониторинг эффективности проводимой терапии посредством объективного отражения ремиссии или возникновения рецидива.
Цель работы заключалась в установлении диагностической значимости сравнительного определения маркеров хронического употребления алкоголя, методами капиллярного электрофореза и биохимического анализа при обследовании различных групп больных алкоголизмом.
Материалы и методы исследования
Исследование проведено на базе Московского научно-практического центре наркологии ДЗ города Москвы в группе мужчин, которое исключает влияние гендерных различий.
Клиническое исследование выполняли в группе больных состоящей из 250 пациентов в возрасте от 23 до 72 лет с установленным диагнозом хронический алкоголизм. Анализ сыворотки крови на содержание маркера карбогидрат-дефицитного трансферрина проводили в динамике, осуществляя забор венозной крови на 1-ый, 7, 14 и 21-ый день лечения. Контрольную группу составили 1000 здоровых доноров. Комплексная оценка больных хроническим алкоголизмом включали данные, о возраст, поле и длительности заболевания. Анализируемые группы пациентов были однородны по всем перечисленным выше характеристикам.
Для установления диагностической значимости маркеров хронического употребления алкоголем проводили определение в сыворотке крови пациентов изоформ гликозилированного трансферрина (CDT) и биохимические показатели содержания печеночных ферментов аланинаминотрансфераза (ALT), аспартатаминотрансфераза (АST), глутаминаминотранспептидазой (GGТ).
Кровь в количестве 5мл забирали в моноветы. Далее пробирки центрифугировали на центрифуге ELMI СМ-6М (Латвия) 5 мин., при скорости 3 тыс. об. мин. После чего сыворотку делили на аликвоты по 1,5 мл в пробирки eppendorf для определения содержания биохимических маркеров и трансферрина. Определение белка CDT проводили на приборе Minicap (Франция). Для определения биохимических маркеров показания крови ALT, AST и GGT по 1 мл сыворотки закапывали в кюветы биохимического анализатора HORIBA ABX Pentra 400 (Франция). Статистический анализ проводили стандартными методами с помощью пакета WinSTAT 2003.1, интегрированного в Excel. При оценке отношения шансов (OR) и значимости отличий частот по точному тесту Фишера использовали свободно распространяемый пакет программ WinPepi: http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html
Результаты исследования и их обсуждение
При хроническом злоупотреблении алкоголя гликозилирование трансферрина нарушается, что приводит к изменению процентного соотношения его изоформ в сторону повышения уровня низкосиалированных вариантов, называемых также карбогидрат-дефицитными, или CDT. Патомеханизм повышения уровня CDT в ответ на хроническое злоупотребление алкоголем заключается, главным образом, в том, что этанол и/ или его метаболит – ацетальдегид влияют на синтез цепей N-гликанов в аппарате Гольджи, ингибируя активность галактозилтрансферазы и N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и одновременно с этим повышая активность сиалидазы в плазматических мембранах печени. Этанол также вызывает дестабилизацию и снижение концентрации м-РНК ?-2,6-сиалилтрансферазы и снижение синтеза ?-2,6-сиалилтрансферазы, обусловленное снижением активности сиалилтрансферазы, и, как следствие, уменьшение сиалирования молекул трансферрина [3,8,9]. Нами были выполнены исследования, направленные на определение диагностической значимости результатов, полученные двумя независимыми методами при обследовании группы лиц с хронической алкогольной зависимостью. Определения маркера CDTпроводили в образцах крови в 1-й, 7, 14 и 21-й дни лечения. Для анализа на биохимические маркеры ALT, AST и GGT использовали образцы 1-й и 21-й дни. При анализе полученных усредненных результатов были выявлены зависимости, представленные на рис. 1, 2.
Как видно из рис. 1, концентрации CDT составляет в среднем 4,31 % при поступлении пациента, на 7 день лечения она уменьшается до 2,27 %. К 14 дню составляла 1,48 %, к 21 дню лечения 1,14 %. Полученные данные свидетельствуют о том, что при полном отказе от алкоголя у пациента происходит снижение концентрации белка и значение CDT приходит в норму за 2-3 недели.
Рис. 1. Зависимость значений CDT от времени
Рис. 2. Зависимость биохимических показателей от времени
На рис. 2 представлена динамика изменения биохимических маркеров. Концентрация ферментов с течением времени так же уменьшается. Однако, даже через 2-3 недели эти значения не нормализуются и остаются высокими. Полученные данные и их значения не позволяют в эти сроки подтвердить полный отказ пациента от алкоголя. Таким образом, сравнивая в динамике уменьшение числового ряда значений CDT и биохимических показателей, характеризующих содержание ферментов, можно заметить, что данные CDT являются более информативными по сравнению с такими маркерами, как ALT,AST и GGT. В отличие от содержания ферментов повышение гликозилированного трансферрина в наименьшей степени ассоциировано с органическим поражением печени или других органов (как алкогольного, так и неалкогольного генеза) или повышенным синтезом микросомальных ферментов. В отличие от других гликопротеинов, недостаток сиалирования изоформ трансферрина никак не связан с клиренсом печени или почек.
Заключение
Проведены сравнительные исследования маркеров хронического злоупотребления алкоголем характеризующих изменения в содержании ферментов и гликозилированного трансферрина. При этом использовали методы биохимического анализа и капиллярного электрофореза. Установлено, что наиболее важными для диагностики ранних состояний алкоголизма являются данные определения CDT.
Таким образом, маркер CDT является универсальным диагностическим инструментом для реализации профилактической и медико-реабилитационной стратегии при заболеваниях зависимости от алкоголь-содержащих веществ. Ключевой составляющей при использовании маркера CDT является объективизация факта злоупотребления алкоголя методами лабораторной диагностики. Представленный маркер CDT на сегодняшний день является единственным маркером оценки хронической алкогольной нагрузки, имеющий опыт практического использования.
Результаты, полученные на основе анализа данных о пациентах с алкоголизмом, послужат основой для разработки стратегий мониторинга рисков, оптимальных терапевтических и профилактических стратегий, а также поиска новых фармакологических мишеней с применением новых методов диагностики такого социально значимого заболевания, как алкоголизм.