Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Пластмассы являются универсальным полимерным материалом, производимым в массовом масштабе и используемым во всем мире. Их производство растет высокими темпами и еще в 2000 году достигло 150 млн тонн в год при ежегодном росте потребления около 7 % [2], увеличивая количество отходов в первую очередь за счет изделий одноразового использования. Для решения проблемы их утилизации и уничтожения создаются различные технологии переработки, однако значительная часть пластмасс попадает на свалки и подвергается случайному или преднамеренному сжиганию. Дым от открытого сжигания пластмассовых изделий содержит в корпускулярной фазе продукты деполимеризации пластика, летучие добавки и продукты их разложения [12]. Кроме того, как было ранее показано нами и другими авторами, в нем содержится множество токсичных соединений, в том числе обладающих канцерогенными и мутагенными свойствами, таких как полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и нитрозосоединения [1, 7]. В то же время мы не нашли работ, посвященных комплексному исследованию канцерогенной опасности выбросов, содержащих продукты прямого сжигания этих видов отходов. В предыдущем исследовании [1] нами была разработана система интегральной оценки канцерогенной опасности продуктов термической переработки твердых бытовых отходов, на основе которой мы предполагаем оценить канцерогенную опасность дымовых выбросов, образующихся при широко практикуемом открытом сжигании пластмассовых и латексных отходов.

Материалы и методы исследования

Работа включала физико-химические и биологические методы исследования. Объектом исследования служили дымовые выбросы при сжигании отходов изделий биомедицинского назначения (чашки Петри, пипетки и латексные перчатки).

Отсортированные изделия сжигали открытым способом. Отбор проб дымовых выбросов проводили с использованием автоматического пробоотборника «ОП-442ТЦ». Для определения ПАУ, нитро-ПАУ отбор проводили с объемной скоростью 5 л/мин на фильтры АФА-РМА-20; для определения летучих N-нитрозосоединений – с объемной скоростью 0,5 л/мин в жидкий поглотитель – 10 % раствор КОН.

Исследование канцерогенных составляющих в дымовых выбросах

Для определения состава и количества ПАУ и нитро-ПАУ фильтры трижды экстрагировали бензолом методом ультразвуковой экстракции (ультразвуковая установка Branson B-12, 50 Гц), экстракты анализируемой пробы объединяли и концентрировали до объема 10 мл. Часть экстракта отбирали для проведения биологических экспериментов. Выделение отдельных соединений проводили методом тонослойной хроматографии на окиси алюминия с использованием в качестве подвижной фазы смести бензол:гексан. Отобранные фракции экстрагировали бензолом; для проведения спектрального анализа в подготовленный к анализу экстракт добавляли н-октановый раствор соответствующего стандартного соединения. При проведении высокоэффективной жидкостной хроматографии экстракты переводили в ацетонитрил. Для биологических методов исследования, в частности, для проведения теста Эймса, первичную экстракцию проводили дихлорметаном.

Для качественного и количественного определения ПАУ и нитро-ПАУ был использован разработанный в нашей лаборатории высокочувствительный спектрально-люминесцентный метод, основанный на избирательном возбуждении спектров флуоресценции замороженных при 77°К поликристаллических н-октановых растворов (эффект Шпольского). Анализ исследуемых соединений осуществляли низкотемпературным спектрально–люминесцентным методом на спектрофлуориметре Hitachi M-850 (Япония) с двойным монохроматором на входе (возбуждение) и выходе (эмиссия люминесценции) и приставкой для низкотемпературной люминесценции (флуоресценции и фосфоресценции) с ксеноновым источником возбуждения [3, 4]

Определение N-нитрозаминов проводилось методом, основанным на извлечении исследуемых соединений водяным паром [5]. Из водного дистиллята экстракцию проводили хлористым метиленом. Экстракт высушивали Na2SO4 и концентрировали до необходимого объема. Анализ проводили методом газохроматографического разделения на хроматографе (газовый хроматограф) с термоэнергетическим детектором ТЕА 810 (Cambridge Scientific Instr.) и компьютерной системой регистрации и обработки данных.

Биологические методы

Бактериальный тест на мутагенную активность (тест Эймса)

Изучение потенциальной мутагенной активности было проведено в соответствии с международным стандартом [8], заключающимся в регистрации способности испытуемого соединения (смеси соединений в экстракте) и/или его метаболитов индуцировать генные мутации типа сдвига считывания или замены пар оснований у индикаторных микроорганизмов (S. Typhymurium TA100 и TA98). Ввиду предполагаемого наличия в выбросах канцерогенов прямого и непрямого действия, была использована методика с активацией проканцерогенов микросомной фракцией клеток печени крысы и без активации. Мутагенный эффект экстрактов сравнивали с действием стандартных генотоксических канцерогенов. Результаты учитывали при наличии мутагенного эффекта во всех вариантах позитивного контроля и в нормальном фоновом варианте.

Тест на промотрную активность

Для изучения промоторной активности выбросов был адаптирован тест, регистрирующий нарушение межклеточных контактов в монослойной культуре клеток крысы [9]. Разобщая клетки, промоторы способствуют выживанию и пролиферации трансформированных злокачественных клеток. Показателем эффекта является ширина зоны распространения флуоресцирующего красителя по обе стороны от нанесенной на монослой царапины. Положительным контролем на разобщение является действие стандартного разобщителя – 12-О-тетродеканоил-форбол-ацетата (ТРА). В работе использовали линию иммортализованных клеток печени крысы IAR-2. Клетки рассевали на 6-луночные планшеты с покровными стеклами на дне. Через 24 часа после посева к клеткам добавляли экстракты в разведениях 1/100, 1/1000, и 1/10000 и инкубировали в течение 72 часов. Разобщение межклеточных контактов определяли после нанесения царапины как отношение среднего числа слоев клеток, в которые произошло проникновение красителя для каждой концентрации исследуемого препарата к среднему числу слоев клеток, в которые произошло проникновение красителя в контрольных образцах (клетки, обработанные растворителем). Количество слоев периферических от «раны» клеток подсчитывали на флуоресцентном микроскопе Zeiss с фотонасадкой (Axioplan 2 imaging), с использованием фильтра для FITC-флуоресценции и при 400-кратном увеличении. Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента для определения М ± m, где М – среднее значение, m – стандарная ошибка среднего, (стандартное отклонение/) с помощью пакета программ Microsoft Excel.

Индукция опухолей у дрозофилы (SMART-тест)

Для выявления бластомогенной активности исследуемых проб использовали оптимизированный протокол теста на соматический мутагенез и рекомбинацию на дрозофиле (SMART), разработанный в нашей лаборатории [11].

Тестирование проводили на личинках дрозофилы гетерозиготных по рецессивной мутации гена супрессора опухолевого роста warts (wts) гомолога человеческого lats. В гомозиготном состоянии этот мутантный ген вызывает опухоли из клеток имагинальных дисков, которые после вылета имаго можно обнаруживать и подсчитывать под бинокулярным микроскопом.

Скрещивание проводили, помещая по 10 самок и 5 самцов в пробирки со стандартной питательной средой на 36–40 ч. Личинок первого возраста F1 обрабатывали испытуемыми соединениями из расчёта 0,2 мл раствора тестируемого вещества на пробирку. В качестве отрицательного контроля использовали дистиллированную воду, поскольку ранее нами было показано, что нет различий в частоте появления клонов при обработке личинок дистиллированной водой, 10 % ДМСО, либо без обработки, в качестве положительного – 0,3 мМ водный раствор оксоплатина (Lachema, Чехия). В предварительных экспериментах по определению токсичности экстрактов дыма для дрозофилы было установлено, что минимальной нетоксической дозой является доза, соответствующая 0,05 л дымового выброса на пробирку. Взрослых самцов и самок из F1 просматривали под бинокулярной лупой на наличие опухолей. Подсчитывали количество просмотренных особей, количество опухолевых клонов и рассчитывали частоту опухолей на 100 особей.

Результаты исследования и их обсуждение

В первой стадии исследования в дымовых выбросах определяли содержание бенз(а)пирена, – индикаторного соединения, характеризующего наличие и состав основных приоритетных ПАУ.

Во всех образцах было отмечено высокое содержание БП, причем при сжигании латексных перчаток количество БП значительно превышало содержание этого соединения в дыме открытого сжигания несортированных бытовых отходов, как было показано нами в предыдущем исследовании (табл. 1).

В дымовых выбросах открытого сжигания образцов было определено количественное содержание ПАУ и ряда нитро-ПАУ, часть из которых обладает высокой канцерогенной и мутагенной активностью (табл. 2).

Таблица 1

Содержание бенз(а)пирена в дыме открытого сжигания

Примечание. * Результат предыдущего исследования [1].

Из данных табл. 2, и рис. 1 видно, что в дыме от сжигания латексных перчаток содержалось наибольшее суммарное количество ПАУ – более 168000 мкг/м3. Также и содержание ПАУ, имеющих высокую канцерогенную активность, было в нем значительно выше, чем в дыме от сжигания пластмассовых изделий. Соотношение количественного содержания отдельных ПАУ различалось. В частности, в дыме от сжигания чашек Петри было в 2–3 раза больше неканцерогенного перилена, по сравнению с другими образцами, a при сжигании латексных перчаток во столько же раз больше слабо канцерогенного бенз(g,h,i)перилена.

Таблица 2

ПАУ и нитро-ПАУ в дыме открытого сжигания

Примечание. *ниже предела чувствительности метода.

Рис. 1. ПАУ в экстрактах дыма от открытого сжигания образцов

При температурах открытого сжигания возможна реакция ПАУ с двуокисью азота с образованием нитро-ПАУ, часть которых является прямыми мутагенами и канцерогенами. Так, неканцерогенный пирен, превращаясь в нитропирены, приобретает эти свойства. В частности 1-нитропирен зарегистрирован как потенциально токсичное, мутагенное и канцерогенное соединение [10]

В продуктах сгорания были определены нитропроизводные ПАУ, обладающие канцерогенными свойствами и являющиеся прямыми мутагенами (табл. 2). Наибольшее суммарное содержание обнаруженных нитро-ПАУ отмечено в дыме сгорания латексных перчаток – более 14000 мкг в м3 .

Формирование ПАУ и нитро-ПАУ зависит от температуры. Температура открытого горения пластмасс и резины сравнительно невелика (от 250 °С), при этих условиях образуется наибольшее количество ароматических углеводородов. Повышение температуры горения приводит к существенному уменьшению формирования большинства ПАУ и нитро-ПАУ, что было показано в наших предыдущих экспериментах с использованием установки ЭЧУТО [1]. По данным литературы известно, что более 99 % нитро-ПАУ, образовавшихся в первичной зоне горения мусоросжигательной установки, разлагаются во вторичной камере сгорания при 900 °С. Кроме того сжигание при разных температурах в зоне горения и газификации зоны влияет на видовой состав ПАУ (минимальный выброс углеводородов достигается при самом высоком значении температуры (1150 °С) и времени удерживания газов в зоне горения [13].

В продуктах открытого сжигания пластмассовых и латексных изделий были обнаружены и канцерогенные N-нитрозамины (рис. 2), которые образуются в результате сжигания материалов, продукты горения которых содержат вторичные амины. Найденные нами соединения обозначены в перечне National Toxicology Program, Department of Health and Human Services; Report on Carcinogens, Thirteenth Edition как потенциально опасные для человека.

В дыме от сжигания чашек Петри и пипеток наибольшая концентрация N-нитрозодиметиламина N-нитрозоморфолина составила 4 и 4, мкг/м3 соответственно. При сжигании латексных перчаток содержание этих соединений составило до 38 и 6,2 мкг/м3 соответственно. ПДК N-нитрозаминов в атмосферном воздухе 0,050 мкг/м3; в воздухе рабочей зоны 2,5 мкг/м3. Поскольку недостаточно работ, посвященных исследованию содержания в промышленных и дымовых выбросах канцерогенных нитрозосоединений, в дальнейших исследованиях необходимо определять вклад этих соединений в состав загрязнений воздушной среды.

Биологические эксперименты

Тест Эймса

Результаты экспериментов представлены в табл. 3 и 4.

Табл. 3 содержит данные, полученные при испытаниях на штамме Salmonella typhimurium TA100, чувствительном к мутагенам, индуцирующим мутации типа замены пар оснований. Даны результаты двух повторных опытов. В каждом опыте представлен фоновый вариант, позитивные контроли с использованием стандартных мутагенов и результаты исследований в вариантах с микросомальной активирующей смесью (+S9) и без нее (–S9).

а

б

в

Рис. 2. Хроматограммы N-нитрозаминов: а – перчатки латекс; б – лабораторные пипетки, пластик; 1 – N-нитрозодиметиламин (НДМА); 2 – N-нитрозодипропиламин (НДПА -внутренний стандарт); 3 –неизвестное соединение; 4 – N-нитрозоморфолин (НДМА); в – хроматограмма стандартной смеси: 1 – N-нитрозодиметиламин (НДМА); 2 – N-нитрозодиэтиламин (НДЭА); 3 – N-нитрозодипропиламин; 4 – N-нитрозодибутиламин (НДБА); 5 – N-нитрозопиперидин (НПИП); 6 – N-нитрозопирролидин (НПИР); 7 – N-нитрозоморфолин (НМОР)

Таблица 3

Действие выбросов открытого сжигания на индикаторный штамм бактерий ТА100 в тесте Эймса (Salmonella/микросомы)

Примечания:

Mi / Mo – отношение числа ревертантов в опыте к числу ревертантов в контроле.

МА – мутагенная активность препарата. «+» означает наличие, «–» отсутствие мутагенной активности.

Табл. 4 содержит результаты аналогичных испытаний, но со штаммом Salmonella typhimurium TA98, чувствительным к мутагенам, индуцирующим мутации типа сдвига рамки считывания. В обеих таблицах активность каждой дозы представлена в виде средних значений (три чашки на дозу).

Как показывают результаты экспериментов, в контрольном (фоновом) варианте частота индуцируемых мутаций не превышала стандартного уровня, соответствующего генетическим особенностям каждого тестерного штамма. Варианты позитивного контроля показали хорошую активность фракции S9: промутагены ААФ и БП индуцировали высокий уровень реверсий. Высокая специфичность мутагенного ответа была подтверждена испытаниями штамма ТА98 с мутагеном ДДДТДП (индуктор мутаций сдвига рамки считывания) и штамма ТА100 с мутагеном НГ (индукция мутаций замены пар оснований).

Исследования мутагенной активности выбросов, полученных при сжигании образцов открытым способом, показали, что в пределах чувствительности данного метода, при достигаемых в препаратах концентрациях органических соединений выбросы экстракты дыма всех трех видов образцов являются мутагенными для штаммов Salmonella typhimurium ТА100 и ТА98. При этом наименьшей мутагенной активностью обладали экстракты дыма от сжигания чашек Петри. Прямой мутагенный эффект на штамме ТА100 (замена пар оснований) наблюдался при концентрации, соответствующей 0,11 л дымового выброса на чашку, тогда как для экстрактов дыма пипеток и перчаток он достигался соответственно при дозах в 2 и 10 раз меньших. Непрямой эффект от проканцерогенных соединений, требующих метаболической активации изоформами цитохрома Р450, был также максимальным от дыма горящего латекса. Достоверное повышение числа ревертантов вызывало его количество в 11 раз меньшее, чем в случае сжигания пластмасс. Содержание прямых мутагенов, вызывающих мутации по типу сдвига рамки считывания (штамм ТА98) было одинаковым для всех экстрактов, в то время как непрямых было на порядок больше в экстрактах дыма горения перчаток.

Таблица 4

Действие выбросов открытого сжигания на индикаторный штамм бактерий ТА98 в тесте Эймса (Salmonella/микросомы)

Примечания:

Mi / Mo – отношение числа ревертантов в опыте к числу ревертантов в контроле.

МА – мутагенная активность препарата. «+» означает наличие, «–» отсутствие мутагенной активности

Деление на прямые и непрямые мутагены в тесте Эймса связано с тем, что у бактерий отсутствуют или слабо активны ферменты, способные превращать проканцерогены в активные метаболиты (изоформы цитохрома Р450), что требует внешней активации испытуемых соединений микросомной фракцией печени млекопитающих, богатой этими ферментами. В связи с этим прямой мутагенный эффект оказываю соединения, не требующие метаболической активации (электрофилы типа нитрозометилмочевины, эпоксидов и диолэпоксидов). При таком условном разделении нитроПАУ попадают в категорию прямых канцерогенов, поскольку в клетках сальмонеллы присутствует система нитроредуктаз, способных превращать нитро ПАУ в электрофильные метаболиты. Таким образом, найденные в выбросах нитро-ПАУ (1-нитропирен, 2-нитрофлуорантен и др.) являются сильными прямыми мутагенами в тесте Эймса и прямая мутагенная активность дыма от сгоревших пластмасс может быть вызвана этими соединениями. Высокая концентрация ПАУ, в том числе канцерогенных, может нести ответственность за непрямую мутагенную активность выбросов.

Нарушение клеточной кооперации экстрактами дымовых выбросов

Из данных табл. 5 видно, что все экстракты дыма в соответствующих разведениях практически одинаково ингибировали распространению в клетках флуоресцирующего красителя, т.е. разобщали их щелевые межклеточные контакты . Эффект был дозозависимым но не пропорциональным концентрации. Так, при разведении экстрактов в 100 раз, от 1∙10–2 до 1∙10–4 доля прокрашенных клеток уменьшалась всего в 2 раза

Кроме того, эффект разобщения не коррелировал с содержанием в экстрактах ПАУ, нитроПАУ и N-нитрозаминов. Канцерогенные варианты этих соединений являются полными канцерогенами, то есть обладают способностью не только инициировать процесс злокачественного превращения клетки, но и промотировать с помощью своих метаболитов выживание и размножение трансформированных клонов. В предыдущем исследовании мы нашли, что агенты, вызывающие разобщение гепатоцитов являются термостойкими соединениями, не разлагающимися при высокой температуре и пиролизе.

Таблица 5

Разобщение клеток экстрактами дымовых выбросов

Примечания:

Во всех случаях доля прокрашенных клеток значимо отличалась от контроля с Н2О (Р<0,01).

* (12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат).

Поскольку способность разобщать клеточные контакты является одним из механизмов промоции канцерогенеза [6], есть основания полагать, что при термическом разложении пластмасс и латексов в атмосферу поступает термостойкий промотор. Дальнейшее исследование этого вопроса представляется весьма важным.

Индукция опухолей у дрозофилы (SMART-тест)

В табл. 6 представлены результаты исследования способности экстрактов корпускулярной фазы, соответствующей 0,05 л дымового выброса индуцировать опухоли у дрозофилы в тесте SMART.

Значимое увеличение частоты появления опухолевых клонов wts/wts, т.е. клонов, в которых произошла инактивация нормального аллеля в результате соматической рекомбинации, точечной мутации, либо генной или хромосомной делеции с образованием гомозиготы по мутантному гену, было получено при обработке личинок экстрактами дыме от сжигания латексных перчаток и пипеток из полистирола, но не чашек Петри, изготовленных также из полистирола (табл. 6). Это может быть связано с тем, что пипетки и чашки Петри были изготовлены из разных типов полистирола, которые подразделяются на атактический, изотакический и синдотактический варианты. Эти типы значительно различаются по структуре молекулы, механическим свойствам и жаропрочности, с которой связана температура термического разложения.

Таблица 6

Индукция опухолей у дрозофилы экстрактами дымовых выбросов

Примечание. * – частота статистически значимо отлична от чистого контроля (дистиллированная вода) Р < 0,01.

Таким образом, экстракты выбросов, полученных при сжигании пипеток и латексных перчаток открытым способом, содержали достаточное количество веществ или комплексов, способные вызывать опухоли у дрозофилы. Причины, по которым экстракты дыма от сжигания чашек Петри не вызвали опухоли на этой модели подлежат дальнейшему исследованию, поскольку содержание в них сильных канцерогенов было сравнимым с их количеством в из дыма от пипеток. В то же время эти экстракты были значительно менее активными индукторами реверсий у сальмонеллы в тесте Эймса. Возможно здесь играет роль тот факт, что содержание в них неканцерогенного пирена было в 2–3 раза выше, чем в двух других. Учитывая тот факт, что система активации проканцерогенов, представленная в клетке изоформами цитохрома Р450 метаболизирует также и пирен, превращая его в столь же неканцерогенные производные, можно предполагать, что пирен конкурирует с канцерогенными ПАУ и блокирует их превращение в активные электрофилы.

Заключение

Полученные результаты свидетельствуют о том, что количественные показатели содержания в сложной смеси отдельных канцерогенов не могут служить единственным критерием оценки канцерогенной опасности всего сложного продукта. В целом, принимая во внимание наши предыдущие исследования, в которых была продемонстрирована чувствительность дрозофилы к канцерогенам млекопитающих, можно со значительной долей вероятности считать исследованные дымовые выбросы канцерогенными для человека, a открытое сжигание наиболее опасным способом их уничтожения.

Современные специализированные мусоросжигающие установки позволяют минимизировать генотоксические выбросы. Ранее мы показали, что сжигание тех же материалов в современной специализированной установки ЭЧУТО (экологически чистая утилизация отходов) с использованием процесса пиролиза резко уменьшает количество канцерогенных соединений в выбросах [1]. Содержание в них бенз(а)пирена даже без процесса пиролиза оказалось на два-три порядка ниже, чем при сжигании открытым способом, a при включении в процесс пиролиза содержание бенз(а)пирена непосредственно на выходе из трубы снизилось до уровня ПДК рабочей зоны. Очевидно, что на границе санитарно-защитной зоны концентрация БП при этом должна снизиться до уровня ПДК в атмосферном воздухе.