В последние годы большое внимание уделяется проблеме цервикальной интраэпителиальной неоплазии различной степени поражения, вызванного вирусом папилломы человека (ВПЧ). Папилломавирусная инфекция (ПВИ) – одна из самых распространенных инфекций в мире, инфицированность вирусом папилломы человека, по данным различных авторов, составляет от 38 до 82 % [1, 2, 5]. Имеются данные, что почти 8 % здорового населения выделяют с мочой вирус папилломы человека 16 типа, а среди женщин, пациенток гинекологических клиник, этот показатель достигает 49 % [1]. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии (CIN) – наиболее частые заболевания, ассоциированные с ПВИ, являются предраковыми поражениями шейки матки [3, 6]. Персистенция вируса с длительной активной экспрессией вирусных онкогенов инициирует многостадийный процесс, в результате которого клетки эпителия шейки матки претерпевают изменения, способствующие опухолевой прогрессии [1, 3, 10]. За последние десятилетия отмечены существенные достижения в проблеме изучения патогенеза заболеваний шейки матки [1, 5]. При этом именно ранние стадии поражения шейки матки, а именно низкая степень цервикального интраэпителиального поражения (LSIL), представляет наибольшую актуальность в начальном аспекте патогенеза, поскольку именно понимание механизма возникновения и прогрессирования процесса на данной стадии дает нам возможность в последующем разработать наиболее эффективную и «щадящую» терапию без применения деструктивных методов. При этом многие авторы приходят к выводу, что инфицирование эпителиальных клеток ВПЧ – необходимое, но недостаточное событие для возникновения цервикальных неоплазий [1, 2, 3, 6]. В настоящее время в литературе обсуждаются различные иммунные и оксидативные нарушения в генезе предраковых заболеваний шейки матки [2, 7, 9]. В некоторых работах по онкоцитобиохимии доказана способность метаболитов перекисного окисления липидов вызывать повреждение ДНК клетки, что послужило открытию оригинальной концепции генотоксического типа оксидативного канцерогенеза [4, 9, 10]. В эпителиальных клетках с интегрированной формой ВПЧ отмечается повышенная экспрессия генов Е6 и Е7, кодирующих эти онкобелки. Было установлено, что там, где наблюдается активная экспрессия белков ВПЧ, отмечен высокий уровень NO. Репродукция ВПЧ индуцирует образование агрессивного метаболита LOO в инфицированных клетках, который является самостоятельным повреждающим фактором и создает дополнительные условия для прогрессирования процесса. В патогенезе каждого паранеопластического процесса значительную роль играет молекулярные и субклеточные механизмы: нарушение транспорта электронов, усиление образования генераторов свободных форм кислорода и пероксидрадикалов, понижение антиоксидантной активности крови. Пероксидазы с функциональной точки зрения являются ферментами, катализирующими в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов [4, 6, 9]. МПО и перекись водорода значительно усиливают бактерицидную активность ряда фенолов посредством перевода их в соответствующие хиноны [6, 8]. Кроме того, МПО в присутствии перекиси водорода и окисляемого кофактора действует против различных микроорганизмов, вирусов, микоплазм, патогенных грибов и участвует в обезвреживании их токсинов [4, 7]. Миелопероксидазная система является основной бактерицидной системой макрофагов, дифференцирующихся из моноцитов при эмиграции последних из крови в очаг воспаления. По количеству пероксидазоположительных макрофагов и по содержанию в них активного фермента можно судить о потенциальной защитной активности слизистой, в том числе и при воспалении урогенитальной системы, вызванной инвазией папилломавирусов [10]. Многие авторы отмечают тесную корреляционную зависимость между активностью лизосомальной кислой фосфатазы и функциональной активностью макрофагов, в особенности их бактерицидной функцией. Руководствуясь этим фактором, а также тем, что, с одной стороны, сенсибилизированные лимфоциты в присутствии антигена могут выделять лимфокины, активирующие макрофаги, в результате чего изменяется их ферментативная активность [4, 7, 9], с другой – сами папилломавирусы и сопутствующая им микрофлора могут оказывать прямые иммунодепрессивные либо активирующие эффекты, изменяя функциональную активность фагоцитов, мы исследовали в соскобах из уретры активность кислой фосфатазы макрофагов. Таким образом, изучение иммуноцитобиохимических дисфункций позволит определить патогенетические особенности LSIL и совершенствовать методы лечения данной патологии.
Целью настоящего исследования явилась оценка состояния цитобиохимического статуса шейки матки у больных с низкой степенью цервикального интраэпителиального поражения (LSIL).
Материалы и методы исследования
В ходе выполнения работы было обследовано 70 человек с низкой степенью цервикального интраэпителиального поражения (LSIL), находившихся на лечении в базовой акушерско-гинекологической клинике КубГМУ, женских консультациях № 4 и № 5 г. Краснодара, ГБУЗ ККБ № 2, Краевом перинатальном центре ГБУЗ ДККБ и 30 условно здоровых женщин (биохимический контроль). Проведено клиническое, кольпоскопическое, цитогистологическое и микробиологическое исследование. С целью исключения потенциального влияния сопутствующих урогенитальных инфекций на исследуемые параметры в группы исследования были включены пациентки с отсутствием или пролеченными не менее, чем за месяц до исследования, урогенитальными инфекциями. Диагноз ПВИ устанавливался на основании клинико-микробиологического и цитологического обследования (жидкостная цитология – технология ThinPrep®, Pap-smear test). Диагностику инфицированности различными типами ВПЧ проводили с помощью ВПЧ Digene-теста (система «HPV Digene-test®»). Исследование цитохимических показателей клеток мононуклеарно-фагоцитарной системы слизистой цервикального канала включало определение активности миелопероксидазы, кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы в макрофагах соскобов матки. МПО исследовали ультрацитохимическим методом по Gracham and Karnovsky, КФ методом одновременного азосочетания по Burstone в модификации Zeya H.С использованием в качестве субстрата нафтол-AS-BI-фосфата при pH 5,0 и в качестве диазосоставляющей прочного гранатового GBC. Мазки фиксировали в парах формалина, докрашивали гематоксилином по Mowry R., НЭ по Burgess A. с использованием в качестве диазосоставляющей прочного синего ВВ с докраской ядерным красным. Активность исследованных ферментов, регистрировали по проценту клеток с выявленной активностью фермента, а также визуальным полуколичественным методом с использованием принципа Kaplow [12]. Состояние окислительных процессов в слизистой шейки матки на фоне LSIL включало определение NO, реактивных форм кислорода (супероксидрадикалы, O2-) и липидов (пероксидрадикалы, LOO-). В основе метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) лежит феномен поглощения микроволнового излучения сверхвысоких частот частицами, обладающими некомпенсированным магнитным моментом. Образцы цервикального смыва помещали в полиэтиленовые трубочки диаметром 0,5 см и длиной 1-1,5 см и замораживали при температуре жидкого азота (– 196 °С). ЭПР – спектры регистрировались на радиоспектрометре РЭ-1307 (Россия), снабженном компьютерной программой накопления сигналов. Для определения содержания свободного оксида азота в образцах цервикального смыва использовали спин-метку-диэтилдитиокарбамат натрия (DETC) (SIGMA) в дозе 1,75 мг на мл жидкости. С целью определения содержания супероксидрадикалов применялась спин-ловушка 5,5диметил-1пиролин-N-оксид (DETC) (SIGMA) дозой 5 мМ DMPO на 1 мл жидкости. С целью определения содержания пероксидрадикалов использовали спин-ловушку α-фенил-tert-бутилнитрон (РBN) (SIGMA) дозой 50 мг PBN на 1 мл жидкости.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили в соответствии с методами, принятыми в вариационной статистике, с использованием свободного программного обеспечения – системы статистического анализа R (R Development Core Team, 2008, достоверным считали различие при р < 0,05). Для оценки корреляционных взаимосвязей отдельных изучаемых параметров использовали коэффициент Пирсона (r).
Результаты исследования и их обсуждение
В ходе проведенного исследования выявляемая активность миелопероксидазы, отражающей один из компонентов кислородзависимой бактерицидной системы макрофагов цервикальной зоны у больных LSIL, была более чем на треть (73,8 ± 9,6 против 208,1 ± 19,3; р < 0,05) ниже таковой у здоровых лиц контрольной группы (рис. 1).
Рис. 1. Активность ферментов (СЦП) макрофагов цервикальной зоны больных LSIL ( % от контроля)
Активность кислой фосфатазы у ВПЧ-инфицированных пациенток практически не отличалась от соответствующего параметра контроля (124,1 ± 12,3 против 138,9 ± 17,5; р < 0,05), тогда как выявляемая активность неспецифической эстеразы, коррелирующая с субактивациоными характеристиками макрофагов у женщин, страдающих LSIL, находилась на достоверно (р < 0,05) более низком уровне (42,3 ± 6,3 против 84,7 ± 7,5; р < 0,05).
Также в ходе проведенных исследований выявлено, что при низкой степени цервикального интраэпителиального поражения интенсивность ЭПР сигнала спинмеченных пероксидрадикалов (LOO-) увеличивается на 60,8 ± 4,1 % (p < 0,05), также регистрируются сигналы супероксидрадикалов (О2-), которые в контрольной группе не регистрируется, увеличение интенсивности сигнала ЭПР спинмеченого оксида азота (NO) возрастает на 50,1 % по сравнению с контролем (рис. 2).
Рис. 2. Содержание свободного оксида азота (NO), реактивных форм кислорода (О2-) и липидов (LOO-) в слизистой шейки матки
Таким образом, исходя из анализа результатов исследований, можно заключить, что в случае ВПЧ-ассоциированного поражения шейки матки легкой степени имеет место угнетение макрофагального звена локального иммунитета, способствующего Th-1 девиации с интенсификацией образования реактивных форм азота и кислорода, которые становятся причиной изменений молекулярных, субклеточных и клеточных структур. Кроме того, в эпителиоцитах усиливается образование реактивных форм кислорода и азота (О2- и NO), что вызывает пероксидативные процессы липидов (LOO-) и интенсивное образование свободнорадикальных форм кислорода. Имеющиеся иммунологические и цитобиохимические изменения при низкой степени цервикального интраэпителиального поражения становятся факторами, нарушающими структуры клеточных мембран, а изменение метаболических процессов играет значительную роль в патогенезе и переходе процесса в более тяжелые формы. Изменения показателей оксидативного статуса цервикальной зоны у больных низкой степенью цервикального интраэпителиального поражения показывают необходимость дифференцированного подхода при коррекции метаболических нарушений, что определяет целесообразность в дополнение к традиционной терапии, использование местных препаратов с антиоксидантной направленностью.