Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Оксид азота (NO) – газообразный, растворимый в воде свободно радикальный внутри- и внеклеточный вторичный мессенджер, обладающий паракринными регуляторными свойствами. В 1998 году в решении Нобелевского комитета по присуждению Нобелевской Премии по Физиологии и Медицине за открытие роли NO было указано, что «NO работает как сигнальная молекула в нервной системе, как оружие в борьбе с инфекциями, как регулятор артериального давления и как фактор, препятствующий кровопотере». Сегодня стало понятно, что биологические функции NO еще более многообразны и участвуют в регуляции работы практически всех органов, тканей и клеток организма. Формируя комплексы с тиолами, белками, полисахаридами, ионами металлов, гемопротеинами, NO образует циркулирующие в кровообращении комплексные соединения, обратимо депонирующие эту молекулу в связанном виде. Многие из этих комплексов и окисленные формы NO в большом количестве переносятся эритроцитами крови. В условиях гипоксии оксид азота высвобождается из молекул-депо, в результате его уровень в кровотоке компенсаторно повышается, обеспечивая вазодилятацию и усиление кровоснабжения. Однако, каков реальный вклад эритроцитов в гипоксическую вазодилятацию в условиях конкретной патологии in vivo, неизвестно, поскольку способов исследования этой функции эритроцитов ранее не существовало.

В настоящей работе представлен впервые разработанный способ оценки NO-генерирующей функции эритроцитов человека и показана возможность его использования в условиях клиники. Предложенный подход может быть использован для оценки вклада данной функции эритроцитов в патогенез заболеваний, связанных с состояниями гипоксии, тромбоза, нарушения регуляции сосудистого тонуса и обмена оксида азота. Полученная информация может быть использована для оценки тяжести, прогноза и эффективности лечения этих заболеваний, а также для поиска новых фармакологических средств коррекции эритроцитарной дисфункции в экспериментальной фармакологии.

Оксид азота несет множество функций в поддержании сосудистого гомеостаза, включая контроль сосудистого тонуса, ингибирование тромбообразования, торможение агрегации эритроцитов, регуляцию экспрессии молекул эндотелиальной адгезии. Свободно-радикальная природа оксида азота, его минимальная способность к диффузии, короткое время жизни и быстрая реакция с гемоглобином позволяют этой молекуле быть местным сигнальным агентом для активации растворимой гуанилатциклазы, что приводит к синтезу цГМФ и к цГМФ-зависимой вазодилятации [9, 10]. В последние годы появились доказательства того, что кроме локального воздействия короткоживущего оксида азота существуют дистантные эффекты этой молекулы, в том числе, вазодилятация, вызванная гипоксией. Дистантные эффекты NO связаны с существованием его циркулирующего резервуара в виде нитрозилированных соединений и молекул нитрита (NO2−) – продукта одноэлектронного окисления NO, присутствующего в эритроцитах (290 нМ) и в плазме (120 нМ) [2]. В тканях с изменением pH и градиента кислорода NO2− восстанавливается разнообразными ферментами и модулирует экспрессию белков, обмен веществ, ангиогенез, цитопротекцию и пр. В кровотоке под влиянием гипоксии нитритредуктаза, взаимодействуя с NO2−, образует NO, вызывая вазодилятацию [14]. В этой реакции нитритредуктазной активностью обладает железосодержащий деоксигенированный гемоглобин [deoxyHb(Fe2+)], формирующий в присутствии протона оксид азота и метгемоглобин. Далее deoxyHb(Fe2+) под действием оксида азота может нитрозилироваться. Нитрит, содержащийся в эритроцитах, может служить источником оксида азота не только за счет нитритредуктазной активности deoxyHb(Fe2+), но также за счет восстановления эритроцитарной ксантиноксидоредуктазой, либо спонтанного или усиленного карбангидразой диспропорционирования [1, 15, 16]. Кроме того, эритроцитарными источниками NO в условиях гипоксии могут быть гем-нитрозил-гемоглобин [8] и S-нитрозогемоглобин [4, 7, 12]. Небольших концентраций оксида азота (EC50 = 5–10 нМ), покидающих эритроциты, достаточно для индукции вазодилятации. Важно, что при гипоксии способность эндотелиальной NO-синтазы генерировать оксид азота весьма лимитирована [3], и в этих условиях основным источником оксида азота становятся эритроциты.

Гипоксическая вазодилятация – фундаментальный компенсаторно-приспособительный ответ, повышающий перфузию ткани при недостатке кислорода. Наряду с повышением доставки кислорода за счет вазодилятации, генерируемый в эритроцитах NO ингибирует митохондриальное дыхание, тем самым уменьшая потребление кислорода [13]. Эти механизмы, а также значение оксида азота в подавлении тромбообразования и агрегации эритроцитов позволяют утверждать, что в условиях ишемии эритроцитарная продукция NO представляет собой ключевой механизм поддержания сосудистого гомеостаза.

Несмотря на столь серьезную роль депонирования и генерации оксида азота в эритроцитах, количественных методов оценки этой функции эритроцитов не существует. В настоящее время используются лишь методы исследования in vivo, оценивающие реакцию сосудистой стенки или содержание в крови метаболитов и дериватов оксида азота.

Цель данной работы – представить способ определения функции эритроцитов генерировать оксид азота и продемонстрировать данные пилотных исследований по применению данного метода у пациентов с сердечно-сосудистой патологией.

Материалы и методы исследования

Выявление гипо-, нормо- или гиперпродукции NO эритроцитами в условиях гипоксии направлено на оценку их вклада в поддержание сосудистого гомеостаза. Принцип метода заключается в том, что одну часть образца стабилизированной крови помещают в условия гипоксии, получают плазму крови и определяют в ней содержание оксида азота, и одновременно содержание оксида азота определяют в плазме другой, не подвергавшейся гипоксии, части образца крови, вычисляют разницу полученных величин, сравнивают с аналогичным значением, полученным в контрольной группе, и по результату сравнения судят о состоянии функции эритроцитов генерировать оксид азота.

В ходе разработки технологии варьировали условия определения, выясняя возможность использования разных антикоагулянтов, способов получения гипоксии in vitro, замораживания образцов плазмы перед определением метаболитов NO, использования теста с физической, пищевой, или фармакологической нагрузкой. Число обследуемых в каждой группе было ≥ 6.

В качестве антикоагулянта использовали цитрат натрия, ЭДТА или гепарин.

Условия гипоксии создавали:

а) помещением образца крови в атмосферу с малым содержанием кислорода, созданную такими приемами, как открытое пламя в замкнутом пространстве или откачивание воздуха или химическое поглощение кислорода или подача инертного газа или газовой смеси газ-генерирующим пакетом или мультигазовым инкубатором;

б) введением поглотителей кислорода, таких как сульфиты или оксираза, непосредственно в образец крови.

Плазму крови перед определением в ней содержания оксида азота использовали сразу после получения или после хранения в замороженном виде.

Результаты измерения выражали в виде концентрации нитритов, приходящихся на эритроцитарную фракцию гематокрита или в виде концентрации нитритов, приходящейся на количество эритроцитов в единице объема крови, в частности, на число эритроцитов в 1 л крови.

Непосредственное определение способности эритроцитов генерировать NO осуществляли следующим образом.

Образцы крови получали натощак из локтевой вены, используя стандартные разовые стерильные вакуумные пробирки с антикоагулянтом. Образец крови обследуемого в объеме 4 мл переносили в два 24-луночного планшета, заполняя в каждом планшете по 2 лунки по 1 мл на лунку. Далее один планшет с кровью помещали на 30 минут в условия искусственно созданной гипоксии, а второй оставляли в условиях атмосферного воздуха. Затем из образцов получали плазму крови и с использованием реактива Грисса [11] по суммарному количеству стабильных метаболитов оксида азота (нитриты и нитраты) определяли количество NO, выделенное эритроцитами. Для определения нитратов восстанавливали их в нитриты, используя металлический кадмий, покрытый медью [11].

Для определения метаболитов оксида азота полученную плазму крови отбирали в 8 пробирок по 150 мкл в каждой, депротеинизировали путем добавления 7,5 мкл 2М ZnSO4, встряхивали на шейкере 2 мин, центрифугировали 10 мин при 12000 g и отбирали супернатант по 100 мкл в чистые пробирки. Пока происходила депротеинизация гранулы кадмия покрывали медью, для чего их трижды промывали деионизированной водой, помещали в 5 мМ раствор CuSO4 на 5 мин, помешивая стеклянной палочкой, затем дважды промывали глицин-NaOH-буфером (pH 9,7), подсушивали и сразу использовали. Для определения нитритов использовали четыре пробирки. В остальные четыре пробирки добавляли по 33 мкл 0,2М глицин-NaOH буфера и 2 гранулы (d ~ 2 мм) кадмия, покрытого медью, встряхивали 15 мин, затем содержимое (жидкую часть) переносили в чистую пробирку и центрифугировали 7 мин при 12000 g. Супернатант использовали для определения нитритов. С этой целью в лунки 96-луночного планшета вносили в дублях по 50 мкл супернатантов, смешивали их с равным объемом реактива Грисса (смесь равных объемов 1 % сульфаниламида в 30 %-ной уксусной кислоте и 0,1 % N-[1-нафтил]-этилендиамин дигидрохлорида в 60 %-ной уксусной кислоте) и через 10 мин на планшетном спектрофотометре при длине волны 540 нм относительно лунок, в которые вместо реактива Грисса добавлена вода, измеряли оптическую плотность образцов. Содержание нитритов рассчитывали по калибровочному графику, построенному с использованием в качестве стандарта NaNO2. Результаты выражали в мкмолях нитритов на 1 л плазмы.

При использовании данного способа определения функции эритроцитов генерировать оксид азота при употреблении обследуемым перед исследованием в пищу или в виде медпрепаратов большого количества нитратов возможны ложноположительные результаты. Для их предотвращения за 2 суток до проведения диагностической процедуры исключалось употребление нитрат-содержащих продуктов и соответствующих лекарств.

Чтобы иметь возможность судить о нормо-, гипо- или гиперфункции эритроцитов в отношении генерации оксида азота нами были определены нормальные значения данной функции в группе условно здоровых лиц (средний возраст составил 53 ± 6 года, поровну мужчин и женщин).

В пилотном исследовании образцы крови получали у пациентов с хронической сердечной недостаточностью, развившейся на фоне ишемической болезни сердца. Условия определения у больных были такими же, как в исследовании группы условно здоровых лиц. В качестве антикоагулянта использовали цитрат натрия.

Всего обследовано 10 мужчин и 8 женщин в возрасте 52 ± 8 лет (женщины – возраст постменопаузы) с ХСН II–IV функционального класса по классификации сердечной недостаточности Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA). Диагноз был верифицирован на основании клинического, биохимического и инструментальных исследований, включая коронарографию и эхокардиографию, и устанавливался в соответствии с Рекомендациями Европейского общества кардиологов (ESC) и Национальными рекомендациями ОССН, РКО и РНМОТ по диагностике и лечению ХСН (четвертый пересмотр). Критериями включения в исследование явились: клинические признаки ХСН II A – III стадии, II–IV ФК в течение 3 месяцев и более; ишемическая этиология ХСН. Критериями исключения были клапанная патология сердца, почечная недостаточность, тяжелые диффузные заболевания печени, декомпенсированные эндокринопатии, психические, инфекционные или онкологические заболевания. При оценке степени тяжести ХСН у 5 (27,8 %) больных выявлен II ФК, 9 (50 %) – III ФК и у 4 (22,2 %) IV ФК ХСН. В 2-ух случаях у пациентов верифицирован острый крупноочаговый инфаркт миокарда, у 4 (22,2 %) больных диагностирован постинфарктный кардиосклероз, у 2 (11,1 %) – стабильная стенокардия напряжения, у 2 (11,1 %) – спонтанная стенокардия. Признаки атеросклероза периферических артерий выявлялись у 66,6 % пациентов, дислипидемия у 77,8 %, цереброваскулярные расстройства у 44,4 %, сопутствующий сахарный диабет II типа – у 16,7 % больных.

Обследование выполнено с одобрения Комитета Биомедицинской Этики ФГБНУ «НИИТПМ» (протокол от 28.02.2015).

Статистическая обработка данных выполнена с использованием программы SPSS, ver. 17. Определялся характер распределения количественных признаков методом Колмогорова-Смирнова. В случае нормального распределения вычислялось среднее значение (М) и стандартная ошибка среднего (m). Достоверность различия показателей оценивали по критериям Стьюдента. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости нулевой гипотезы (p) принимался равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты исследования с конкретными условиями определения NO-генерирующей функции эритроцитов в группе условно здоровых лиц представлены таблице.

Результаты исследования (таблица) свидетельствуют, что все использованные в исследовании условия позволяют адекватно судить об NO-генерирующей функции эритроцитов при сравнении с соответствующим контролем. Кроме того, представленные в таблице результаты свидетельствуют, что данный способ имеет высокий уровень воспроизводимости.

Значения NO-генерирующей функции эритроцитов у условно здоровых лиц при разных условиях определения (M ± m)

Примечания. * – первая цифра – абсолютное значение (мкмоль/л) / вторая – кратность изменения; ** – расчёт производится по формуле: содержание NO (мкмоль/л)/значение гематокрита (в долях от единицы); § – различия между соответствующими группами до и после гипоксии значимы при p ≤ 0,05; # – то же при – p ≤ 0,001.

Исследование способности эритроцитов генерировать NO у больных с хронической сердечной (ХСН) недостаточностью показало, что эта функция у части больных значительно усилена, тогда как у другой части, наоборот, резко снижена, а значения находящиеся в пределах нормы почти не встречаются. Анализ показал, что повышенная генерация NO гипоксическими эритроцитами наблюдается у больных, имеющих множественную хроническую коморбидную патологию с компенсированными формами ишемических расстройств. Уровни гипоксия-индуцированной продукции оксида азота колебались у таких пациентов в пределах 7,8–9,4, составляя в среднем 7,5 ± 1,6 мкМ NO2/n×1012 эритроцитов. Низкие значения – в пределах 0,68–1,62 (среднее = 1,15 ± 0,74 мкМ NO2/n×1012 эритроцитов) – обнаруживались у наиболее тяжелых больных, находящихся в стадии обострения и/или имеющих признаки острой ишемии. У таких больных наблюдались, например, острый тромбоз левого желудочка в сочетании с ишемической кардиомиопатией, острый крупноочаговый инфаркт миокарда, ухудшение течения ИБС с тяжелыми приступами спонтанной стенокардии в сочетании с гипертонической болезнью III стадии и выраженным атеросклерозом ряда магистральных артерий, декомпенсация ХСН в сочетании с ИБС и пароксизмом тахисистолической фибрилляции-трепетания предсердий и др.

В трех наблюдениях мы зарегистрировали относительно высокие значения генерации NO в пересчете на число эритроцитов при нарушениях со стороны эритрона, таких как гипохромная анемия и/или снижение численности эритроцитов и гематокрита. При этом без пересчета на эритроциты гипоксия-индуцированная продукция оксида азота была невелика. Полученные результаты позволяют говорить, что NO-генерирующая функция эритроцитов при ХСН варьирует в широких пределах, что, очевидно, связано со стадией/скоростью эритроцит-зависимой адаптации организма к условиям гипоксии и с возможностями включения эритрона в компенсаторно-приспособительный процесс [10]. При длительных ишемических состояниях механизмы генерации оксида азота в эритроцитах, по-видимому, успевают полностью включиться в процессы обеспечения сосудистого гомеостаза, и происходит гиперпродукция NO в эритроцитах, тогда как при острых сосудистых катастрофах наблюдается эритроцитарная дисфункция и обеспечиваемая красными кровяными клетками гипоксическая вазодилятация развивается в недостаточном объеме. Какие механизмы участвуют в up-регуляции эритроцитарной генерации NO при хроническом ишемическом процессе – пока неизвестно. Известен АТФ-опосредованный механизм вазодилятации, при котором эритроциты выделяют АТФ, а тот, в свою очередь, активирует эндотелиальную NO-синтазу [2]. Вероятность серьезного вклада этого механизма в усиление перфузии ишемизированной ткани невелика, поскольку эндотелиальная NO-синтаза в условиях гипоксии не работает. Другой механизм – восстановление нитрита до NO деоксигемоглобином, включает трансмембранное поступление нитрита внутрь эритроцитов, выход NO из клетки или формирование промежуточных метаболитов типа N2O3 [4]. Многие считают этот механизм маловероятным, так как обычная концентрация NO2 in vivo недостаточна для формирования физиологически значимых уровней NO, что обусловлено присутствием в плазме Hb и окси-Hb, быстро комплексующихся с NO, предотвращая его появление в свободном виде. Впрочем, неферментативное восстановление нитрита нуждается в кислой среде, а в зоне ишемии рН обычно ниже 6. В этой зоне возможно диспропорционирование NO2 до NO спонтанным и карбангидраза-катализируемым путем. Третий механизм увеличения эритроцитарной продукции NO может быть связан с активностью образованного при оксигенировании эритроцитов в легких гемоглобина, S-нитрозилированного оксидом азота на β-цепи по цистеину Cys93 [3]. В дексигенированной крови S-нитрозилированный Hb (SNO-Hb) высвобождает NO на низкомолекулярные или связанные с белком тиолы, такие как глутатион или анионообменный белок-1 [12]. Весьма вероятно, гипоксия-зависимая повышенная генерация оксида азота обусловлена указанными механизмами, а ее снижение – их повреждением. Не исключено, что эритроцитарная гипо- или гиперпродукция NO регулируется и иными механизмами, например регуляцией активности ксантин-оксиредуктазы или зависимым от воспаления балансом образования и распада комплекса FeNO-гемоглобин [15].

Заключение

Таким образом, нами предложен простой и надежный метод определения способности эритроцитов генерировать оксид азота при гипоксии. На примере хронической сердечной недостаточности продемонстрировано, что данный метод вполне применим в клинических условиях и может выявлять значительные изменения этой эритроцитарной функции. При этом у больных ХСН впервые удалось обнаружить явления эритроцитарной дисфункции, зависимые от характера течения процесса.