Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Широкое распространение электромагнитных излучений техногенного происхождения обуславливает необходимость исследования влияния данного экологического фактора на внутриклеточные процессы [1]. При этом показано влияние низкоинтенсивных электромагнитных полей на внутриклеточные сигнальные системы, что определяет существенное биологическое значение данных факторов в клеточной физиологии [8, 13, 16]. Экспериментальное подтверждение биологических эффектов низкоинтенсивных электромагнитных излучений миллиметрового (КВЧ) и дециметрового (СВЧ) диапазона, формирующихся при участии молекул воды, определяет использование данных факторов в биомедицинских технологиях [1, 5, 11, 14]. Учитывая нерешенность вопроса о влиянии низкоинтенсивного СВЧ-излучения (микроволн) на внутриклеточные процессы, с одной стороны, и проникновение излучений во все сферы жизнедеятельности современного человека, с другой, исследования биохимических изменений, сопутствующих воздействию низкоинтенсивных микроволн, являются в настоящее время высоко актуальными [1, 5].

Цель исследования – изучение внутриклеточного уровня в агранулоцитах цельной крови белков теплового шока, гистона Н3, продукции цитокинов и эффекторных молекул врожденного иммунного ответа в норме, а так же под воздействием кратковременного облучения цельной крови микроволнами частотой 1 ГГц.

Материалы и методы исследования

В исследование включено 15 практически здоровых лиц мужского пола из числа доноров крови в возрасте 25-35 лет. Материалом исследования служила венозная кровь, забираемая в утреннее время в ходе планового профилактического осмотра. Путем разделения пробы венозной крови (8,0 мл) от каждого обследуемого на 4 равные части, формировали группы исследования. Первая (1) группа включала необлученные образцы крови (n = 15), 2-я – образцы, облученные при мощности излучения 0,01 мкВт/см2, 3-я – образцы, подвергнутые облучению при мощности излучения 0,05 мкВт/см2, 4-я – образцы, подвергнутые облучению при мощности излучения 0,1 мкВт/см2 [4, 9, 12].

При работе с образцами, включая облучение и культивирование, использовали наборы «Цитокин-Стимул-Бест» (ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск). Облучение крови, смешанной со средой DMEM в соотношении 1:4 проводили аппаратом микроволновой терапии «Акватон-02» (ООО «ТЕЛЕМАК», г. Саратов), на частоте 1,0 ± 0,01 ГГц в течение 45 минут [2, 16]. После облучения флаконы помещались на 24 часа в термостат при 37 °С с последующим выделением на градиенте фиколл-верографина (ρ = 1,077) мононуклеарных лейкоцитов (МНК) и приготовлением их лизатов, для чего использовали 1 мл клеточной суспензии содержащих 0,5-1.10⁷ клеток. Подсчет клеток и анализ жизнеспособности осуществляли с помощью счетчика TC20 (Bio-Rad, США). Жизнеспособность клеток составляла не менее 90 %.

Оценка молекулярных маркеров патологического процесса проводилась методом ИФА и включала определение в клеточном супернатанте концентрации интерлейкинов (ИЛ) ИЛ-4, ИЛ-11, ИЛ-15, ИЛ-18, субъединицы р70 ИЛ-12, хемокинов RANTES и MIP3α, факторов роста TGFβ, FGFβ, VEGF-A, VEGF-C, G-CSF. В клеточном супернатанте исследован уровень липополисахарид-связывающего белка (ЛПСБ), белка клеток Клара (БКК), миелопероксидазы (МПО), окиси азота (NO), бактерицидного белка, увеличивающего проницаемость мембран (BPI), матриксной металлопротеазы-1 (ММП-1), индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS), фосфорилированной формы белка теплового шока (БТШ) БТШ27 и БТШ90, а так же общий уровень антиоксидантов (АОС).

В клеточных лизатах исследовали уровень фосфорилированной формы гистона Н3, фосфорилированной по тирозину/треонину 183/185 c-jun-NH2 терминальной протеинкиназы JNK изоформы 1 и 2 (JNK1/2), фосфорилированной по тирозину/треонину в положении 202/204 протеинкиназы ERK изоформы 1 и 2 (ERK1/2), фосфорилированной по треонину/тирозину в положении 180/182 протеинкиназы p38, фосфорилированной по серину в положениях 217/221 протеинкиназы MEK изоформы 1, а так же фосфорилированной по серину в положении 473 протеинкиназы AKT изоформы 1 (AKT1). При проведении анализа использовали наборы производства BenderMedsystems (Австрия), R&D Systems Inc. (США), AssayPro (США).

Статистическую обработку проводили в программе Statistica 7,0. В ходе исследования оценивалось выборочное среднее значение показателя (х), выборочное среднеквадратичное отклонение (s). Статистическую значимость (р) межгрупповых различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Содержание в МНК практически здоровых лиц исследованных факторов представлено в табл. 1.

Таблица 1

Результаты исследования (нг/мл)

Анализ внутриклеточного содержания молекул, вовлеченных в трансдукцию рецепторных сигналов, свидетельствует о том, что в агранулоцитах цельной крови практически здоровых лиц из числа терминальных протеинкиназ MAPK-сигнального пути большим содержанием отличается ERK1/2, минимальным – протеинкиназа р38.

Проведенный анализ биологических эффектов низкоинтенсивного излучения частотой 1 ГГц показал, что под влиянием облучения культуры клеток цельной крови внутриклеточный уровень р38 в агранулоцитах возрастал с 2,6 до 21,1 % (t = 4,6; p = 0,019), МЕК1 – с 3,17 до 14,3 % (t = 13,0; p = 0,001), JNK1/2 – с 0,61 до 4,29 % (t = 8,7; p = 0,0032), ERK1/2 – c 0,63 до 2,85 % (t = 9,1; p = 0,0028). На этом фоне уровень фосфорилирования гистона Н3 повышался с 0,72 до 2,51 % (t = 9,9; p = 0,022), а содержание протеинкиназы АКТ1, напротив, снижалось с 0,83 до 5,79 % (t = 12,2; p = 0,0012).

С учетом значения t-критерия, отражающего абсолютную величину межгрупповых различий облученных и необлученных культур, а, следовательно, эффекты излучения, влияние облучения на внутриклеточный уровень исследованных молекул в агранулоцитах убывает в следующем ряду: MEK1; AKT1; ERK1/2; JNK1/2; p38.

В табл. 2 представлены результаты оценки концентрации цитокинов и факторов роста в клеточных супернатантах.

Результаты проведенного анализа концентрации цитокинов в клеточном супернатанте свидетельствуют о том, что в культурах цельной крови практически здоровых лиц наблюдается стимуляция активации Т-хелперов 2-го типа, в сравнении с Тх1, на что указывает соотношение концентраций цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-12 составляющее 1,55 ед.

Проведенный анализ биологического эффекта микроволн частотой 1 ГГц на продукцию клетками цитокинов, показал, что облучение стимулирует в большей мере продукцию ИЛ-4 и ИЛ-15. При этом уровень ИЛ-4 в облученных культурах возрастал с 10,4 до 22,6 % (t = 7,7; p = 0,0046), а ИЛ-15 с 7,9 до 18,4 % (t = 5,3; p = 0,013). На этом фоне продукция ИЛ-12 возрастала с 4,4 до 14,7 % (t = 9,7; p = 0,0024), ИЛ-18 с 7,14 до 14,3 % (t = 5,6; p = 0,0115), ИЛ-11 с 3,21 до 8,33 % (t = 8,3; p = 0,0036).

Проведенный анализ выявил чувствительность продукции хемокина, экспрессируемого и секретируемого T-клетками при активации (RANTES) к воздействию низкоинтенсивного СВЧ-облучения. При этом его уровень под влиянием облучения возрастал с 3,4 до 10,1 % (t = 2,1; p = 0,1). На этом фоне продукция MIP3α увеличивалась менее выражено, повышаясь на 4,9 % при максимальной мощности излучения (t = 12,3; p = 0,011).

Из исследованных факторов роста, продукция FGFβ являлась более чувствительной к облучению, возрастая в облученных культурах c 3,5 до 12,8 % (t = 12,3; p = 0,012). Продукция TGFβ при соответствующем увеличении мощности воздействия на клетки возрастала с 3,2 до 7,5 % (t = 3,5; p = 0,039), VEGF-A – с 4,0 до 7,2 % (t = 4,0; p = 0,0273), VEGF-C – с 5,0 до 12,9 % (t = 35,0; p = 0,0001), G-CSF – с 0,97 до 2,4 % (t = 17,1; p = 0,0004).

С учетом величины t-критерия, отражающего влияние СВЧ-излучения на продукцию рассмотренных цитокинов, эффекты рассматриваемого воздействия на продукцию клетками исследованных факторов убывают в следующем ряду: VEGF-C; G-CSF; MIP3α; FGFβ; ИЛ-12; ИЛ-11; ИЛ-4; ИЛ-18; ИЛ-15; VEGF-A; TGFβ; RANTES.

Таблица 2

Концентрация цитокинов в группах (пг/мл)

Таблица 3

Уровень исследованных факторов в группах

Таблица 4

Влияние микроволн на активность фагоцитов цельной крови

В табл. 3 представлены показатели, отражающие состояние неспецифической резистентности клеток цельной крови у обследованных лиц.

Проведенный анализ показал, что наибольший эффект облучение оказало на продукцию клетками цельной крови белка клеток Клара, уровень которого, при изменении мощности облучения в диапазоне 0,01-0,1 мкВт/см2, возрастал с 3,1 до 16,9 % (t = 6,5; p = 0,0014). Содержание МПО в супернатанте возрастало с 2,56 до 14,1 % (t = 6,5; p = 0,007), продукция ЛПСБ – с 1,94 до 7,8 % (t = 23,0; p = 0,0002), BPI – с 1,45 до 4,8 % (t = 15,1; p = 0,0006).

Под воздействием низкоинтенсивного СВЧ-излучения с 0,3 до 1,04 % (t = 12,2; p = 0,0012) возрастал уровень iNOS, при этом концентрация в клеточном супернатанте самого NO повышалась с 0,36 до 2,14 % (t = 9,0; p = 0,003). Так же в супернатанте облученных культур имело место повышение содержания ММП-1 с 0,92 до 7,34 % (t = 6,4; p = 0,008).

Повышение мощности излучения с 0,01 до 0,1 мкВт/см2 так же ассоциировалось с повышением экспрессии белков теплового шока, в частности фосфорилированной формы БТШ27 с 2,07 до 5,7 % (t = 7,7; p = 0,005), а так же БТШ90 с 0,64 до 1,93 % (t = 16,2; p = 0,0005).

С учетом величины t-критерия, влияние облучения культуры клеток цельной крови на продукцию эффекторных факторов клеточной резистентности убывает в следующем ряду: ЛПСБ; БТШ90; BPI; iNOS; АОС; БКК; NO; БТШ27; МПО; ММП-1.

Результаты анализа влияния СВЧ-облучения на активность фагоцитов цельной крови здоровых лиц представлены в табл. 4.

Анализ функционального состояния фагоцитов цельной крови практически здоровых лиц свидетельствует об усилении активности фагоцитоза под влиянием облучения. При этом под влиянием максимальной мощности излучения отмечается статистически значимое повышение ФИ на 14,0 % (р = 0,023), а ФЧ на 99,7 % (р = 0,01).

Воздействие низкоинтенсивных микроволн частотой 1000 МГц на культуру клеток цельной крови сопровождается четким биологическим эффектом, проявляющимся активацией внутриклеточных биохимических процессов с изменением продукции регуляторных и эффекторных молекул межклеточных взаимодействий, а так же изменением чувствительности клеток к их воздействию за счет модификации внутриклеточных сигнальных каскадов [6, 15, 17]. При этом повышение уровня БТШ в облученных культурах является одним из проявлений адаптивной реакции клеточной системы на электромагнитное излучение. Усиление фосфорилирования гистона Н3, наблюдающееся под влиянием облучения, отражает активацию генов и индукцию раннего ответа, указывая, кроме того, на возможность активации микроволнами эпигенетических механизмов регуляции клеточного метаболизма [1, 3].

Вместе с тем, представляется, что первичной мишенью излучения являются протеинкиназы МАРК-сигнального пути, в частности, протеинкиназа МЕК1, уровень фосфорилирования которой существенно изменяется в облученных культурах. В свою очередь, активированная протеинкиназа МЕК1, фосфорилируя терминальные протеинкиназы данного пути (в частности разные изоформы протеинкиназы ERK), а так же возможно и другие субстраты, в частности гистон Н3, БТШ27, активирует немедленные гены предранней реакции (c-fos, c-jun и т.п.), стимулируя транскрипцию генов эндогенных антимикробных пептидов, цитокинов, БТШ [3, 10, 11].

Таким образом, под влиянием низкоинтенсивного СВЧ-излучения частотой 1 ГГц происходит активация стресс-лимитирующих клеточных программ, реализующихся через активацию МАРК/SAPK-сигнального пути.

Кроме этого, проведенный анализ показал, что низкоинтенсивное излучение частотой 1 ГГц способствует снижению активности PI3K/AKT/mTOR-сигнального пути, о чем свидетельствует дефосфорилирование одного из ключевых его факторов – протеинкиназы АКТ1. Указанное обстоятельство свидетельствует о влиянии излучения на регуляцию метаболического статуса иммунокомпетентных клеток [7].

Результатом внутриклеточных сдвигов, реализующихся в облученных клетках, является повышение их функциональной активности. Учитывая динамику цитокинового профиля в облученных культурах, можно полагать, что повышение эффективности данного процесса достигается за счет активации как специфических, так и неспецифических защитных механизмов при стимуляции клеток информационными молекулами, продукция которых усиливается под влиянием микроволн [6, 11, 8]. При этом такие изменения развиваются достаточно быстро, что в ряде случае способствует повышению выживаемости животных в условиях острого дистресса, что указывает на активацию под влиянием микроволн немедленных генов предранней реакции [4, 9, 11].

Так, очевидно, что стимуляция секреции ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, определяет повышение активности цитотоксических клеток, включая NK и CD8+ лимфоциты, а повышение уровня ИЛ-4, ИЛ-11, ИЛ-18 стимулирует активность Т-хелперов 2 типа, активацию В-лимфоцитов и, как следствие, продукцию ими иммуноглобулинов и противовирусных факторов [6, 11, 13]. Таким образом под влиянием облучения имеет место активация моноцитарно-макрофагальной системы неспецифической защиты, а так же адаптивной иммунной системы представленной Т-, В- и NK клетками.

Стимуляция продукции факторов роста, матриксных металлопротеиназ, в частности ММП-1, а так же NO, повышение антиоксидантного потенциала межклеточной среды, способствует активации репаративных и регенеративных процессов в тканях, обновлению внеклеточного матрикса, торможению процессов старения соединительной ткани [6, 8].

Модифицируя состояние внутриклеточных сигнальных путей в МНК и цитокинового профиля межклеточной среды, низкоинтенсивные микроволны частотой 1 ГГц обеспечивают пространственно-временную синхронизацию их функциональной активности, повышение адаптационного потенциала и стрессоустойчивости.

Выводы

1. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что микроволны частотой 1 ГГц стимулируют MAPAK/SAPK-сигнальный путь трансдукции рецепторных сигналов, за счет активации протеинкиназы МЕК1 и терминальных протеинкиназ JNK1/2 и ERK1/2.

2. Микроволновое облучение стимулирует продукцию клетками цитокинов, регулирующих активность неспецифической защиты и адаптивного иммунного ответа, наиболее значимо повышая уровень ИЛ-4 и ИЛ-15, а так же секрецию FGFβ.

3. Под влиянием облучения повышается продукция эндогенных антимикробных пептидов, в частности БКК и МПО, отмечается усиление продукции БТШ90, фосфорилирования БТШ27 и гистона Н3, указывающее на активацию генетических программ, направленных на формирование стресс-лимитирующих и адаптивных реакций.