Проблема заживления и лечения ран была и остается одной из самых актуальных проблем современной медицины [1]. Инфекционные осложнения ран являются не менее важной проблемой хирургии [1]. Одной из причин развития микрофлоры в ране является нарушение как общего, так и местного иммунного статуса. Недооценка важности диагностики и коррекции нарушений функции иммунной системы может приводить к развитию иммунодефицитных состояний и ухудшению течения патологического процесса [1, 6]. Работа посвящена оценке роли секреторных продуктов нейтрофилов в регуляции локальных реакций воспаления и иммунитета. Известно, что выделяемые нейтрофилами биологически активные продукты способны существенно влиять на протекание различных физиологических и патологических процессов в организме [3, 5]. При этом изучение механизмов индукции и торможения местных иммунных реакций занимает достойное место в комплексе современных клинико-иммунологических исследований.
Целью исследования было изучение влияния аутологичных супернатантов активированных латексом нейтрофилов крови на функциональную активность фагоцитов в поврежденных тканях, на бактериологическое состояние раны, на регенеративные процессы в ране.
Материалы и методы исследования
Выделение секреторных продуктов гранулоцитов с использованием микросфер латекса проводили с помощью метода, разработанного И.И. Долгушиным и соавт., 1987 [2]. Оценку эффективности местного применения супернатантов аутологичных нейтрофилов крови проводили у 30 больных с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей туловища и конечностей, для чего всех больных обследовали дважды: на 5-6 сутки и 13-14 сутки после оперативного вмешательства (определяли клеточный состав раневого отделяемого, функциональную активность фагоцитов в ране). Оценку уровня бактериальной обсемененности раны проводили в 1 сутки и на 13-14 сутки после поступления больного в стационар. После проверки аутологичных супернатантов нейтрофилов на стерильность и иммунотропную активность больным опытной группы на фоне комплексного лечения по общепринятой схеме местно назначали выделенные аутологичные секреторные продукты нейтрофилов пятикратно с интервалом в 24 часа в дозе 0,5-1,0 мл супернатанта, разведенного в 4,0 мл стерильного изотонического раствора NaCl. Доза аутологичных нейтрофилокинов определялась уровнем активности содержащихся в них иммуностимулирующих факторов при сравнении на моноцитах донора со стандартными суммированными донорскими супернатантами гранулоцитов, имеющими установленный уровень иммуностимулирующей активности. Выбор сроков начала локального применения аутологичных нейтрофилокинов обусловлен тем, что на 7 сутки наблюдения у больных с раневой хирургической инфекцией сохранялся дисбаланс в функциональной активности фагоцитов в ране, отмечалось развитие неполноценной регенерации поврежденных тканей, не снижался уровень инфицирования ран. Помимо этого, при проверке стерильности полученных супернатантов нейтрофилов должно пройти не менее 7 суток. Группу сравнения составили 20 пациентов с аналогичной патологией, которые получали лечение по общепринятой схеме. В качестве плацебо использовали изотонический раствор NaCl в аналогичной дозе и кратности применения. Клиническое испытание было рандомизированным. Опытная группа и группа сравнения были сопоставимы по возрасту, полу, локализации гнойного раневого процесса, тяжести заболевания, сопутствующей патологии. Состояние раны у больных с раневой хирургической инфекцией оценивали при помощи цитологического исследования отделяемого из раны [4]. Изучали показатели функциональной активности нейтрофилов и макрофагов, выделенных из раны (фагоцитарной, НСТ-редуцирующей, лизосомальной) [3, 5]. Кроме того, были проведены бактериологические методы исследования, заключающиеся в идентификации возбудителей раневой инфекции и определении их чувствительности к антибактериальным препаратам, а также количественное определение содержания микроорганизмов (КОЕ) в 1,0 мл раневого отделяемого.
Полученные результаты исследований были подвергнуты статистической обработке с использованием пакетов статистических программ STADIA 6.3, Statistica for Windows 5.0.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования показали, что аутологичные нейтрофилокины влияют на характер клеточного состава раневого отделяемого у больных с раневой хирургической инфекцией, достоверно снижая количество нейтрофилов и увеличивая содержание макрофагов, что свидетельствует о происходящих в ране процессах регенерации, так как под влиянием ряда медиаторов макрофагов формируется грануляционная ткань [1, 6]. Напротив, в группе сравнения на 13-14 сутки после оперативного вмешательства сохранялось высокое содержание гранулоцитов на фоне низкого уровня макрофагов, что указывает на сохранение остроты воспаления и наличие неполноценной регенерации поврежденных тканей (табл. 1).
Таблица 1
Влияние аутологичных нейтрофилокинов на клеточный состав раневого отделяемого у больных с раневой хирургической инфекцией (М ± m)
|
Показатели клеточного состава раневого отделяемого |
Группа сравнения |
Больные, получавшие местно аутонейтрофилокины |
||
|
5-6 сутки n = 10 |
13-14 сутки n = 10 |
5-6 сутки n = 11 |
13-14 сутки n = 11 |
|
|
Лейкоциты (106/мл раневого отделяемого) |
4.19 ± 0.92 |
2.6 ± 0.81 |
4.8 ± 1.41 |
1.29 ± 0.16* |
|
Нейтрофилы ( %) |
82.0 ± 2.13 |
65.9 ± 3.51 |
86.0 ± 2.09 |
43.7 ± 2.62*, ** |
|
Нейтрофилы (106/мл) |
3.48 ± 0.75 |
1.84 ± 0.67 |
4.14 ± 1.25 |
0.58 ± 0.09* |
|
Макрофаги ( %) |
10.7 ± 1.49 |
16.7 ± 2.16 |
8.7 ± 1.55 |
40.8 ± 3.37*, ** |
|
Макрофаги (106/мл) |
0.39 ± 0.09 |
0.4 ± 0.12 |
0.35 ± 0.08 |
0.52 ± 0.06 |
|
Лимфоциты ( %) |
8.25 ± 1.79 |
17.4 ± 2.87 |
5.9 ± 1.42 |
15.4 ± 2.24* |
|
Лимфоциты (106/мл) |
0.38 ± 0.14 |
0.42 ± 0.12 |
0.28 ± 0.09 |
0.19 ± 0.04 |
Примечание. * – достоверность различий показателей внутри группы больных (между данными первого и второго обследования); ** – достоверность различий показателей первых и повторных исследований разных групп больных. Использован критерий Вилкоксона.
Оценка функциональной активности фагоцитов в ране у больных в группе сравнения с учетом общепринятых нормальных значений естественной резистентности организма выявила нарушение иммунореактивности этих клеток в динамике воспалительного процесса: угнетение фагоцитарной реактивности макрофагов, высокие значения кислородзависимого метаболизма поли- и мононуклеарных фагоцитов, которые сохранялись на протяжении всего периода наблюдения; снижение функционального резерва и лизосомальной активности изучаемых клеток. Отсутствие статистически значимых изменений между показателями первого и второго обследования свидетельствовало о сохраняющемся дисбалансе в функциональной активности фагоцитов в ране у больных в группе сравнения на протяжении всего периода наблюдения. Местное применение аутологичных нейтрофилокинов у больных с раневой хирургической инфекцией устраняло развитие дисбаланса в функциональной активности гранулоцитов и макрофагов в ране, способствовало развитию полноценной регенерации поврежденных тканей (табл. 2, 3).
Таблица 2
Влияние аутологичных нейтрофилокинов на функциональную активность нейтрофилов в ране у больных с раневой хирургической инфекцией (М ± m)
|
Показатели функциональной активности нейтрофилов в ране |
Группа сравнения |
Больные, получавшие местно аутонейтрофилокины |
||
|
5-6 сутки n = 10 |
13-14 сутки n = 10 |
5-6 сутки n = 11 |
13-14 сутки n = 11 |
|
|
Активность фагоцитоза ( %) |
32.6 ± 3.91 |
60.2 ± 3.03* |
63.3 ± 7.49** |
44.6 ± 3.79** |
|
Интенсивность фагоцитоза (у.е.) |
0.81 ± 0.14 |
1.21 ± 0.15 |
1.26 ± 0.22 |
1.75 ± 0.15 |
|
Фагоцитарное число (у.е.) |
2.58 ± 0.35 |
2.03 ± 0.24 |
2.14 ± 0.35 |
4.0 ± 0.27*, ** |
|
Спонтанный НСТ-тест, активность ( %) |
60.0 ± 9.02 |
70.9 ± 7.93 |
69.5 ± 8.04 |
47.7 ± 2.84 |
|
Спонтанный НСТ-тест, индекс (у.е.) |
0.62 ± 0.1 |
0.81 ± 0.1 |
0.76 ± 0.1 |
0.51 ± 0.04 |
|
Индуцированный НСТ-тест, активность ( %) |
66.7 ± 9.95 |
62.7 ± 7.11 |
70.4 ± 8.36 |
66.0 ± 3.52 |
|
Индуцированный НСТ-тест, индекс (у.е.) |
0.7 ± 0.11 |
0.72 ± 0.1 |
0.86 ± 0.15 |
0.7 ± 0.04 |
|
Функциональный резерв |
1.26 ± 0.23 |
0.97 ± 0.12 |
1.23 ± 0.24 |
1.45 ± 0.07** |
|
Лизосомальная активность (у.е.) |
220.9 ± 12.34 |
72.8 ± 8.25* |
312.4 ± 20.81** |
289.5 ± 18.62** |
Примечание. * – достоверность различий показателей внутри группы больных (между данными первого и второго обследования); ** – достоверность различий показателей первых и повторных исследований разных групп больных. Использован критерий Вилкоксона.
Таблица 3
Влияние аутологичных нейтрофилокинов на функциональную активность макрофагов в ране у больных с раневой хирургической инфекцией (М ± m)
|
Показатели функциональной активности макрофагов в ране |
Группа сравнения |
Больные, получавшие местно аутонейтрофилокины |
||
|
5-6 сутки n = 10 |
13-14 сутки n = 10 |
5-6 сутки n = 11 |
13-14 сутки n = 11 |
|
|
Активность фагоцитоза ( %) |
36.6 ± 4.1 |
28.8 ± 3.37 |
37.2 ± 3.13 |
57.6 ± 4.96*, ** |
|
Интенсивность фагоцитоза (у.е.) |
1.11 ± 0.18 |
0.67 ± 0.11 |
1.12 ± 0.15 |
2.16 ± 0.3*, ** |
|
Фагоцитарное число (у.е.) |
3.1 ± 0.48 |
2.33 ± 0.2 |
2.98 ± 0.29 |
3.77 ± 0.41** |
|
Спонтанный НСТ-тест, активность ( %) |
63.0 ± 10.52 |
71.0 ± 7.99 |
74.6 ± 6.34 |
41.3 ± 4.31*, ** |
|
Спонтанный НСТ-тест, индекс (у.е.) |
0.69 ± 0.13 |
0.79 ± 0.08 |
0.9 ± 0.08 |
0.42 ± 0.04*, ** |
|
Индуцированный НСТ-тест, активность ( %) |
66.3 ± 9.04 |
59.5 ± 5.3 |
67.2 ± 7.82 |
77.7 ± 5.53 |
|
Индуцированный НСТ-тест, индекс (у.е.) |
0.71 ± 0.1 |
0.77 ± 0.09 |
0.79 ± 0.1 |
0.86 ± 0.06 |
|
Функциональный резерв |
1.29 ± 0.2 |
0.95 ± 0.12 |
0.95 ± 0.13 |
2.12 ± 0.26*, ** |
|
Лизосомальная активность (у.е.) |
67.2 ± 12.74 |
62.9 ± 7.65 |
86.9 ± 11.83 |
167.6 ± 17.1*, ** |
Примечание. * – достоверность различий показателей внутри группы больных (между данными первого и второго обследования);** – достоверность различий показателей первых и повторных исследований разных групп больных. Использован критерий Вилкоксона.
После установленного иммуномодулирующего влияния аутологичных секреторных продуктов ПМЯЛ на показатели местного иммунитета интересно было изучить бактериологическое состояние раны у больных после проведенной локальной иммунокоррекции, ибо можно было предположить, что секреторные продукты нейтрофилов, устраняя развитие дисбаланса в функциональной активности фагоцитов в ране, влияют на уровень бактериальной обсемененности поврежденных тканей.
Бактериологическое состояние раны изучали дважды: в 1 сутки и на 13-14 сутки после поступления больного в стационар. При бактериологическом исследовании мы проводили качественное и количественное изучение раневой микрофлоры.
Результаты исследований показали, что в 1 сутки после поступления в стационар у больных опытной группы и группы сравнения были выделены стафилококки: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus и стрептококки: Streptococcus pyogenes.
На 13-14 сутки лечения в стационаре, после проведения у больных способа локальной иммунокоррекции с помощью аутологичных нейтрофилокинов получена следующая картина микробного пейзажа. Уменьшилось количество больных с обнаруженным золотистым стафилококком, не зарегистрировано ни одного случая повторного инфицирования ран. При этом увеличилось количество пациентов, у которых отделяемое из раны было незначительным, оно имело серозный характер, рана выполнялась яркими грануляциями. У больных группы сравнения содержание в раневом отделяемом Staphylococcus aureus сохранялось на исходном уровне, а также присоединялась Грам (-) микрофлора (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia). Это сопровождалось увеличением количества гнойного отделяемого из раны. В ране отмечались единичные участки некроза. Грануляции становились вялыми, бледными, тусклыми, медленно выполняли полость раны.
При количественной оценке бактериологического состояния ран между исследуемыми группами больных не было выявлено достоверной разницы в исходных значениях. Анализ количественного изучения раневой микрофлоры при повторном обследовании обнаружил, что в опытной группе в 3 и более раза уменьшилось количество пациентов с критическим уровнем бактериальной обсемененности ран 105 и более микробных клеток/1,0 мл раневого отделяемого. Тогда как в группе сравнения количество больных с критическим уровнем бактериальной обсемененности раны возросло более чем в 3 раза. Общее количество микроорганизмов в 1,0 мл отделяемого из раны у больных опытной группы достоверно снизилось более чем в 20 раз по сравнению с исходными данными и более чем в 50 раз по сравнению с данными повторного обследования в группе сравнения (табл. 4).
Таблица 4
Влияние аутологичных нейтрофилокинов на количество микроорганизмов в 1,0 мл раневого отделяемого у больных с раневой хирургической инфекцией (M ± m)
|
Показатель обсемененности ран |
Группа сравнения n = 10 |
Больные, получавшие местно аутонейтрофилокины n = 10 |
||
|
1 сутки |
13-14 сутки |
1 сутки |
13-14 сутки |
|
|
Общее количество микроорганизмов в 1,0 мл раневого отделяемого у всех больных в группе |
2.5·106 ± ± 1.6·106 |
5.3·106 ± ± 1.8·106 |
2.2·106 ± ± 1.3·106 |
1.0·105 ± ± 9.9·104 * |
Примечание. * – достоверность различий показателей внутри группы больных (между данными первого и второго обследования). Использован критерий Вилкоксона.
Таким образом, при проведении у больных с раневой хирургической инфекцией локальной иммунокоррекции с помощью аутологичных нейтрофилокинов уменьшался уровень бактериальной обсемененности ран, не развивалась вторичная инфекция.
Заключение
Местное применение аутологичных нейтрофилокинов у больных с раневой хирургической инфекцией увеличивает количество макрофагов в ране, устраняет развитие дисбаланса в функциональной активности гранулоцитов и макрофагов в ране, улучшает бактериологическое состояние раны, обеспечивает очищение раны, способствует развитию полноценной регенерации поврежденных тканей.