Точная идентификация наследственных заболеваний часто затруднена, прежде всего из-за отсутствия при большинстве наследственных болезней патогномоничных признаков. Сложности в диагностике врожденных и наследственных нарушений связаны со сходством их клинических признаков, которые обусловлены мутациями различных генов. Диагностику наследственных заболеваний также затрудняет фенотипический полиморфизм нарушений, когда при одной и той же унаследованной генной мутации могут развиться как ее ярко выраженные, так и стертые или даже различные клинические формы. Трудности диагностики наследственных заболеваний также связаны с существованием некоторых генетических явлений, оказывающих существенное влияние на формирование клинического фенотипа, таких как, мозаицизм, экспансия аллелей, однородительское наследование (дисомия и изодисомия) и геномный импринтинг [5, 18, 20].
Важнейшая роль в диагностике наследственных болезней принадлежит лабораторным исследованиям: цитогенетическим, молекулярно-генетическим, биохимическим и др. Существенная доля пациентов, обратившихся к врачу-генетику, нуждается в уточнении диагноза с помощью специальных методов исследования. В современной медико-генетической практике классические генетические методы дополнены высокотехнологичными методами, такими как, молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические, методы иммунологического анализа [10, 11].
Хромосомные болезни – это обширная группа врожденных патологических состояний, проявляющихся аномалиями развития и обусловленных нарушениями числа или структуры хромосом в соматических клетках или половых клетках. Клиническая симптоматика хромосомной патологии разнообразна, однако одним из ведущих симптомов является задержка нервно-психического развития [5].
Своевременное проведение хромосомного анализа имеет большое значение для выявления причин возникновения и прогнозирования многих наследственных и врожденных пороков развития. В России, в практическом здравоохранении исследования кариотипа проводятся с 1966 года. В лабораториях медицинской цитогенетики для анализа хромосомных аномалий используются классические методы цитогенетического анализа, базирующиеся на дифференциальном окрашивании хромосом. Эти методы позволяют выявлять все численные нарушения и значительную часть структурных хромосомных перестроек. Однако в ряде случаев разрешающей способности этих методов оказывается недостаточно для успешного проведения диагностики хромосомных аномалий, например, для точного определения границ точек разрывов при инверсиях и транслокациях, для определения происхождения дополнительного хромосомного материала при несбалансированных транслокациях [1, 13, 16].
Возможности цитогенетического анализа значительно расширились благодаря появлению и развитию новых высокоинформативных молекулярно-цитогенетических методов, главный из которых – флюоресцентная гибридизация in situ – FISH-метод (от англ. fluorescent in situ hybridization). Метод позволят проводить гибридизацию метафазных или интерфазных хромосом с различными ДНК-зондами. Зонды – клонированные последовательности или выделенные участки ДНК, комплементарные участку ДНК исследуемого кариотипа и меченные флюоресцирующими веществами. Наиболее часто используют высокоповторяющиеся последовательности ДНК центромерных или перицентромерных районов, однако в ряде случаев возникает необходимость в применении уникальных ДНК-последовательностей, таких как, космидные клоны, YAС – пробы, анонимные последовательности и др., что обеспечивает детальное исследование генетической структуры хромосомных перестроек, например маркерных хромосом, а также анализ точек разрывов хромосом в различных типах транслокаций, делеций, дупликаций, инверсий, инсерций, дицентрических и кольцевых хромосом [10, 14].
Принцип метода заключается в следующем: 1 – для изучаемой хромосомы или ее участка готовят однонитевой участок ДНК, к которому присоединяются метки – биотин или дигоксигенин (такой участок ДНК называется ДНК-зондом); 2 – на микроскопическом препарате in situ при обработке щелочью хромосомная ДНК денатурирует, т.е. разрываются водородные связи между двумя нитями ДНК; 3 – препарат обрабатывают ДНК-зондом. Поскольку нити ДНК взаимокомплементарны, зонд присоединяется к соответствующему участку хромосомы. В этом участке восстанавливается двойная спираль (ренатурация ДНК). Причем можно одновременно использовать множественные зонды к разным локусам; 4 – полученный препарат обрабатывают химическими соединениями, которые способны избирательно присоединяться к биотину или дигоксигенину; 5 – к полученным комплексам присоединяют флюоресцентные красители (двухцветная или трехцветная флюоресцентная гибридизация и т.д.); 6. – с помощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы можно увидеть на фоне неокрашенных [5, 9].
Метод FISH применяется очень широко – от локализации гена до расшифровки сложных перестроек между несколькими хромосомами. Метод можно применять для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах – интерфазная цитогенетика. Метод экономичен и занимает меньше времени, чем кариотипирование дифференциально окрашенных хромосом. Неоспоримое преимущество интерфазной цитогенетики – отсутствие необходимости в приготовлении препаратов метафазных хромосом и культивировании клеток. Это снимает многие вопросы, связанные с возникновением артефактов, присущих длительным культурам клеток (полиплоидизация in vitro, возникновение и клональная селекция клеток с аберрациями кариотипа, изменение пропорций клеточных клонов при хромосомном мозаицизме) [5].
FISH на интерфазных хромосомах служит быстрым методом пренатальной диагностики трисомий по 21, 18 или 13 хромосомам или аберраций половых хромосом [12]. Например, можно получить информацию о количестве 21-х хромосом в клетках амниотической жидкости (пренатальная – дородовая диагностика синдрома Дауна у плода) – специфический ДНК – зонд для 21-ой хромосомы покажет в ядрах этих клеток или две светящиеся точки, что соответствует двум 21-м хромосомам, или три – что выявит трисомию по 21-ой хромосоме [17]. Методы молекулярной цитогенетики позволили повысить верификацию хромосомных болезней. При использовании обычных цитогенетических анализов – доля невыявленных случаев составила 10 %, при использовании FISH – технологии – снизилась до 0,9 – 1,5 % [18, 19].
Исследования, проведенные Л.С. Балевой, свидетельствуют о том, что выявление субтеломерных и теломерных перестроек с помощью молекулярно-цитогенетических методов в комплексе с классической цитогенетической диагностикой может вносить значительный вклад в диагностику недифференцированных форм умственной отсталости у детей. Частота таких перестроек, по данным разных авторов, составляет от 0,5 до 7,4 %. Корреляция теломерных и субтеломерных аномалий хромосом с определенной клинической картиной может способствовать вычленению новых хромосомных синдромов из большой группы недифференцированных форм умственной отсталости [1].
Проведено цитогенетическое и молекулярно-цитогенетическое исследование у 3593 детей с недифференцированными формами умственной отсталости, множественными врожденными пороками и/или микроаномалиями развития. В результате цитогенетического анализа авторы, помимо хромосомных аномалий, выявили хромосомные варианты и инверсии околоцентрамерного гетерохроматина хромосом 1, 9, 13-17, 21, 22 и Y. Количественная FISH с применением ДНК проб, специфически маркирующих вариабельные участки гетерохроматина хромосом, подтвердила цитогенетические данные и позволяет оценить непосредственно содержание ДНК в данном хромосомном участке и считается прямым методом исследования. До сих пор нет единого взгляда на роль вариантов околоцентромерного гетерохроматина в развитии той или иной патологии. Авторы предположили, что возможно при соответствующих обстоятельствах эти участки могут оказывать влияние на нарушение функциональной активности генов, находящихся от них в непосредственной близости, – так называемый эффект положения генов [3].
Структурные хромосомные аномалии в виде делеций и дупликаций небольшого размера составляют значительную долю хромосомной патологии среди детей с задержкой развития, аутизмом, пороками и аномалиями развития. А.Д. Колотий привела результаты лабораторной диагностики хромосомных микроперестроек у 14-ти детей с недифференцированными формами умственной отсталости, пороками и/или малыми аномалиями развития. При проведении цитогенетического исследования методами дифференциального окрашивания хромосомная патология у этих детей не была выявлена. Данные случаи сложны для цитогенетической диагностики, поскольку могут быть связаны с микроаномалиями кариотипа, выявление которых возможно только с применением молекулярно-цитогенетических методов исследования. Применение специального алгоритма анализа хромосомных нарушений, включающего гибридизацию на хромосомах in situ позволило выявить микроаномалии кариотипа и определить этиологические причины хромосомной патологии у всех 14 детей. Применение современных диагностических технологий позволяет не только повысить эффективность молекулярно-цитогенетической диагностики за счет выявления микронарушений генома у детей с нарушениями психики, но также выявлять новые нозологии из недифференцированных (идиопатических) форм умственной отсталости [7].
Анеуплоидии гоносом являются наиболее распространенными хромосомными синдромами после трисомии хромосомы 21. Частота их составляет не менее 0,3 % в общей популяции. При этих синдромах довольно часто выявляются мозаичные формы, когда в клетках одной или различных тканей присутствуют две или более клеточные линии с разным хромосомным набором. Основной задачей при исследовании мозаичных форм численных хромосомных аномалий является эффективное определение доли клеток аномального клона для прогнозирования течения болезни и корректного медико-генетического консультирования семьи. Особые сложности возникают при выявлении низкопроцентного мозаицизма, при котором одна из клеточных линий присутствует в 10 % клеток и менее. Результаты исследований Демидовой И.А. показывают, что в этом случае традиционный цитогенетический метод для постнатальных исследований кариотипа малоэффективен. Более того, при повторных цитогенетических исследованиях в процессе культивирования может наблюдаться селективный отбор клеток с численными аномалиями хромосом или без них вплоть до полной элиминации одного из клонов. Однако отсутствие анеуплоидных клеток в последующих исследованиях не говорит об отсутствии анеуплоидии. Выявление «скрытого» хромосомного мозаицизма с помощью современных молекулярно-цитогенетических методов может объяснить причину заболевания, определить прогноз и провести лечебную коррекцию, особенно при мозаичных формах численных аномалий половых хромосом [4].
Хромосомный мозаицизм чаще наблюдается при численных хромосомных аномалиях в отличие от структурных, что было установлено многими исследованиями. Результаты исследования Колотий А.Д. показали, что после цитогенетического анализа хромосомный мозаицизм наблюдался у 3,4 % от всех изучаемых больных. После проведения молекулярно-цитогенетического исследования доля случаев с хромосомным мозаицизмом составила 5,9 %. Установлено, что выявление возможного мозаицизма молекулярно-цитогенетическими методами диагностики требуется пациентам со стертой клинической картиной таких хромосомных синдромов, как Дауна, Эдвардса, Шерешевского-Тернера, трисомии Х, а также девочкам с дисгенезией гонад при нормальном кариотипе, определенном цитогенетическим методом. Своевременная эффективная диагностика мозаичных форм хромосомных аномалий способствует лечебной коррекции, особенно при мозаичных формах аномалий половых хромосом [6, 8, 15].
В работе Берешевой А.К. представлено сообщение о 8-летней девочке с мозаичной формой синдрома Шерешевского-Тернера. Цитогенетическое исследование показало мозаичную форму синдрома при наличии клона клеток с кольцевой хромосомой Х и отсутствии нормального клона. Методом FISH подтвердили моносомию хромосомы Х и обнаружили дополнительный клон клеток с тремя хромосомами Х. Нормальный клон клеток с кариотипом 46,ХХ не выявлен. Multicolor banding (многоцветовое окрашивание) показало делецию псевдоаутосомного участка в коротком плече и делецию концевых участков короткого и длинного плеч кольцевой хромосомы Х во всех клетках. Таким образом, применение высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических методов позволило определить потерю псевдоаутосомного участка в Хp22.32, ответственного за низкий рост, черепно-лицевые, скелетные аномалии, и критического участка Xp22.1, который ведет к симптомокомплексу синдрома Шерешевского-Тернера. Использование современных молекулярно-цитогенетических методов способствовало повышению уровня медико-генетического консультирования, что обеспечивает назначение корректного симптоматического лечения [2, 8].
В работе Минайчевой Л.И. отражено применение молекулярно-цитогенетического метода в клинической практике. Беременная женщина 30 лет обратилась в Генетическую клинику института для проведения эхографического исследования плода на 21 неделе гестации. При обследовании был выявлен порок развития сердечно-сосудистой системы. Для исключения хромосомной патологии было проведено инвазивное вмешательство (кордоцентез) и получен плодный материал. Стандартный цитогенетический анализ (G-окраска) не выявил структурных и числовых нарушений – 46, XY. При осмотре врачом-генетиком в возрасте 3-х месяцев выявлены множественные стигмы дизэмбриогенеза – эпикант, короткий нос с открытыми вперед ноздрями, широкая верхняя челюсть, микрогнатия, оттопыренные уши, отмечалась мышечная гипотония и прогрессирующая деформация позвоночника, что позволило заподозрить наличие генетической патологии и провести дополнительное обследование с использованием молекулярно-цитогенетических методов. Методом FISH была выявлена микроделеция в хромосоме 7 в критической области синдрома Вильямса. Верификация диагноза у пациента в достаточно раннем возрасте позволила скорректировать план наблюдения и разработать индивидуальный комплекс профилактических, лечебных и реабилитационных мероприятий [9].
Заключение
Таким образом, флюоресцентная гибридизация in situ в настоящее время является одним из наиболее эффективных и широко используемых методов молекулярной цитогенетики, позволяет установить и уточнить диагноз хромосомной патологии, что способствуют повышению уровня генетического консультирования, а также эффективной профилактике хромосомных заболеваний.