Влияния факторов окружающей среды вызывают стресс-реакцию, которая в зависимости от интенсивности и продолжительности оказывает различное действие на биологические системы, может служить сигналом угрозы нарушения гомеостаза с развитием физиологических и патологических изменений [12, 14]. При адекватной стресс-реакции происходит усиленный выброс стресс-гормонов, опосредующих развитие адаптации [5]. Вместе с тем, при высокой интенсивности действия стрессора адаптационные реакции могут оказывать повреждающие эффекты и приводить к развитию патологии [6].
Стресс влияет на многие системы организма, в том числе и лимбическую, модулируя обучение, память, эмоции; двигательные функции, участвует в механизмах их нарушений [15]. Иммобилизационный стресс является причиной тревоги, снижения локомоторной активности, приводит к дисфункции памяти [13]. Помимо этого, стресс-индуцированное повышение активности гипофизарно-адренокортикальной и симпатоадреналовой систем вызывает развитие гипертонии [2, 9].
Все живые организмы по-разному реагируют на стрессорные изменения окружающей среды. Имеются данные, что высокоустойчивые к стрессу животные обладают большими способностями к адаптации, чем низкоустойчивые [11]. Ряд авторов объясняют это генетически обусловленным уровнем эффективности стресс-лимитирующих систем [7, 8].
Одной из основных стресс-лимитирующих систем в организме является NO-ергическая система. Оксид азота ограничивает активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и симпатоадреналовой систем и тем самым снижает повреждающие эффекты стресс-реакции [5]. Также показано, что устойчивость к стрессорным повреждениям находится в прямой зависимости от уровня реактивности NO-системы [7].
В связи с этим, целью исследования явилось изучение влияния блокады NO-ергической системы на устойчивость животных с различным фенотипом реакции на стрессорную ситуацию к 6-ти, 12-ти и 24-х часовому иммобилизационно-болевому воздействию.
Материалы и методы исследования
Эксперименты проведены на 60 беспородных крысах-самках массой 230-250 г в возрасте четырех месяцев, предварительно отобранных по их устойчивости к стрессу, в фазу диэструса, которая определялась по влагалищным мазкам. Животные были получены из ФГУП «Питомник лабораторных животных Рапполово» (Ленинградская область) и содержались в условиях вивария ВолгГМУ. Уход за ними осуществлялся согласно рекомендациям национального стандарта Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», Международных рекомендаций «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [The European Convention, 1986]. Протокол экспериментального исследования был одобрен Региональным Независимым Этическим Комитетом (ГУ Волгоградский Медицинский Научный Центр) (протокол № 198-2014 от 25.04.2014 г.).
Стресс моделировали путем подвешивания крысы за дорсальную кожную шейную складку на 6, 12 и 24 часа [1]. Потенциальная устойчивость животных к стрессу определялась по отношению суммы горизонтальной двигательной активности в центре и на периферии к сумме латентных периодов первого движения и выхода в центр (коэффициент стресс-резистентности, КСР) [4]. В зависимости от величины КСР животные были разделены на высокоустойчивых (высокоактивных) (КСР = 1,1 – 4,0) и низкоустойчивых (низкоактивных) (КСР = 0,27 – 0,70) к стрессу. Было сформировано 8 групп: 1 и 2 – высоко- и низкоустойчивые интактные самки (в обеих группах по 8 животных); 3 и 4 высоко- и низкоустойчивые интактные самки, получавшие неселективный ингибитор NO-синтаз L-NAME в дозе 10 мг/кг дважды (после измерения исходного уровня артериального давления и через 12 часов) (в обеих группах по 6 животных); 5 и 6 – высоко- и низкоустойчивые стрессированные животные (в обеих группах по 8 животных); 7 и 8 – высоко- и низкоустойчивые стрессированные крысы, получавшие L-NAME за 10 мин до и через 12 часов после подвешивания (в обеих группах по 8 животных).
У всех самок до эксперимента и через 6, 12 и 24 часа регистрировалось среднее артериальное давление (срАД) с помощью прибора для неинвазивного измерения Kent Scientific Corporation (Канада). После подвешивания крыс с помощью веб-камер с датчиками движения производили видеозапись двигательной активности крыс в течение всего времени иммобилизационно-болевого воздействия. Время активности животного выражали в процентах от общей продолжительности стрессирования.
Статистическую обработку результатов проводили в программе «Statistica 6.0» с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни, Краскелла-Уоллиса и Сигела-Кастеллана. Нормальность распределения оценивали с использованием критерия Шапиро-Уилка.
Результаты исследования и их обсуждение
Подавление синтеза оксида азота с помощью неселективного ингибитора NO-синтаз вызывало значительное снижение устойчивости к стрессу и гибель животных. В группе высокоустойчивых крыс, получавших L-NAME, погибла одна самка через 22 часа после начала стрессирования, в группе низкоустойчивых крыс на фоне дефицита оксида азота во время 6- и 12-часового стрессирования погибли по две крысы, во время 24–часовой иммобилизации – ещё три. Гибели не наблюдалось в группах стрессированных животных без блокады синтеза NO (см. табл. 1).
Таблица 1
Влияние иммобилизационно-болевого стресса и блокады NO-синтаз на уровень срАД животных с различными типами реагирования на стрессорные воздействия
|
Группы животных |
Среднее АД |
|||
|
Исход |
6 часов |
12 часов |
24 часа |
|
|
Высокоустойчивые к стрессу животные |
||||
|
Интактная |
103,3 ± 7,0 |
98,2 ± 5,2 |
98,1 ± 3,9 |
97,8 ± 8,3 |
|
Интактная + L-NAME |
104,1 ± 5,4 |
108,8 ± 5,2 |
122,1 ± 6,4* |
137,9 ± 7,1* |
|
Стресс + физ. р-р |
98,4 ± 4,7 |
106,1 ± 5,0$ |
107,9 ± 5,2*$ |
114,2 ± 10,9* |
|
Стресс + L-NAME |
101,9 ± 3,7 |
106,5 ± 4,4 |
106,6 ± 6,1 |
92,8 ± 4,5#^ |
|
Низкоустойчивые к стрессу животные |
||||
|
Интактная |
103,3 ± 5,7 |
100,9 ± 6,8 |
97,3 ± 5,4 |
98,5 ± 3,0 |
|
Интактная + L-NAME |
103,8 ± 4,1 |
118,2 ± 5,4* |
123,1 ± 3,5* |
127,8 ± 4,5* |
|
Стресс + физ. р-р |
99,8 ± 4,1 |
107,1 ± 2,9 |
109,6 ± 3,1*$ |
107,2 ± 5,9& |
|
Стресс + L-NAME |
100,8 ± 7,3 |
86,5 ± 6,1»* |
Не определялось |
|
Примечание. * – изменения достоверны по сравнению с исходным уровнем срАД (критерий Краскела-Уоллиса, Сигела-Кастеллана при p ≤ 0,05).
^ – изменения достоверны по сравнению с уровнем срАД через 6 и 12 часов стрессирования (критерий Краскела-Уоллиса, Сигела-Кастеллана при p ≤ 0,05).
$ – изменения достоверны по сравнению с уровнем срАД интактных животных(критерий Краскела-Уоллиса, Сигела-Кастеллана при p ≤ 0,05).
# – изменения достоверны по сравнению с уровнем срАД высокоустойчивых крыс через 24 часа стрессирования без блокады NO-синтаз (критерий Краскела-Уоллиса, Сигела-Кастеллана при p ≤ 0,05).
« – изменения достоверны по сравнению с исходным уровнем срАД низкоустойчивых крыс (критерий Краскела-Уоллиса, Сигела-Кастеллана при p ≤ 0,05).
& – изменения достоверны по сравнению с уровнем срАД высокоустойчивых крыс через 24 часа стрессирования (критерий Манна-Уитни при p ≤ 0,05).
У интактных высоко- и низкоустойчивых самок срАД в течение 24 часов существенно не изменялось, а на фоне блокады синтеза NO значительно повышалось (p ≤ 0,05) относительного исходного уровня. При стрессовом воздействии у высокоустойчивых крыс исследуемый показатель повышался по сравнению с исходными данными с увеличением времени стрессирования; у одной самки из восьми срАД снижалось. У 6 из 8 низкоустойчивых животных после 6- и 12-часового подвешивания наблюдался подъем срАД (p ≤ 0,05) относительно исходных данных, к 24 часу показатель оставался на уровне 12-часового, у 2 самок из 8 срАД снижалось на протяжении всего времени стрессирования.
У высокоактивных стрессированных самок прирост срАД к 6, 12 и 24 часам был статистически достоверно выше по сравнению с таковым интактной группы; у низкоактивных – существенно не отличался, за исключением 12 часового показателя (см. табл. 1).
У высокоустойчивых крыс, получавших блокатор NO-синтаз L-NAME, срАД через 6 и 12 часов иммобилизационно-болевого стрессорного воздействия не изменялось по сравнению с исходными данными, к 24 часу отмечена тенденция к снижению. Через 6 часов стрессирования у 5 из 8 низкоустойчивых самок с блокадой синтеза оксида азота срАД было (р ≤ 0,05) ниже относительно фоновых значений, у одной крысы – выше исходного уровня. Через 12 часов срАД не определялось, что сопровождалось впоследствии гибелью животных (см. табл. 1).
При сравнении изменений срАД у высокоустойчивых самок в условиях стресса и при введении L-NAME отмечено, что дефицит оксида азота способствует достоверному снижению срАД к 24 часу. У низкоустойчивых стрессированных животных с блокадой синтеза оксида азота резкое снижение исследуемого показателя по сравнению с самками, находившимися в условиях только стрессорного воздействия, наблюдался уже к 6 часу, а к 12 часу не определялся и животные погибали.
Выявлено, что у стрессированных высокоустойчивых животных без блокады NO-синтаз, в отличие от низкоустойчивых, через 24 часа уровень срАД был выше (p ≤ 0,05) (см. табл. 1).
Мы в литературе не нашли работ, анализирующих поведение животных (попытки избавления от болевого воздействия) с разным типом реагирования в условиях иммобилизационно-болевого стресса. Можно было предположить, что высокоустойчивые животные будут вести себя более активно при подвешивании за холку.
Однако процент времени активности крыс от общей продолжительности иммобилизации был ниже в период 12-24 часа, тогда как в остальное время практически не изменялся (p ≤ 0,05 по сравнению с общей двигательной активностью за 6 часов стрессирования). Наиболее выраженное уменьшение данного показателя наблюдалось в группах самок, получавших ингибитор NO-синтаз L-NAME. В группе низкоустойчивых к стрессу животных наблюдалась тенденция к более длительной активности по сравнению с высокоустойчивыми (см. табл. 2).
Таблица 2
Влияние блокады NO-синтаз на время активности животных во время стрессирования
|
Группы животных |
Время активности, % от общего времени стрессирования |
||
|
6 ч |
12 ч |
24 ч |
|
|
Высокоустойчивые к стрессу животные |
|||
|
Стресс + физ. р-р |
76,7 ± 6,2 |
73,8 ± 12,4 |
60,8 ± 8,1* |
|
Стресс + L-NAME |
75,4 ± 7,0 |
66,3 ± 8,4 |
48,5 ± 6,5*# |
|
Низкоустойчивые к стрессу животные |
|||
|
Стресс + физ. р-р |
83,4 ± 5,6 |
82,0 ± 13,8 |
70,8 ± 6,4* |
|
Стресс + L-NAME |
81,4 ± 6,2 |
69,0 ± 7,5^# |
- |
Примечание. В группе низкоустойчивых стрессированных животных, получавших L-NAME, выжила только одна крыса.
* – изменения достоверны по сравнению с общей двигательной активностью за 6 часов стрессирования (критерий Краскела-Уоллиса, Сигела-Кастеллана при p ≤ 0,05).
^ – изменения достоверны по сравнению с общей двигательной активностью за 6 часов стрессирования (критерий Манна-Уитни при p ≤ 0,05).
# – изменения достоверны по сравнению с общей двигательной активностью стрессированных животных без блокады NO-синтаз (критерий Манна-Уитни при p ≤ 0,05).
Таким образом, у интактных животных, получавших блокатор NO-синтаз L-NAME, уровень артериального давления достоверно повышался, что, вероятно, связано со снижением вазодилатирующей функции эндотелия, повышением чувствительности сосудов к действию ангиотензина II, обусловленного дефицитом оксида азота [16]. У стрессированных крыс исследуемый показатель возрастал с увеличением продолжительности иммобилизации, что согласуется с литературными данными и вызвано гиперактивацией гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и симпато-адреналовой систем при стрессе [6]. У животных, получавших блокатор NO-синтаз L-NAME, происходило выраженное снижение уровня АД: у крыс с высокой устойчивостью к стрессу данный показатель уменьшался к 24 часам иммобилизационно-болевого воздействия, у низкоустойчивых – уже через 6 часов. Это указывает на важную роль системы оксида азота в формировании гомеостатических реакций при воздействии стрессорных факторов и свидетельствует о зависимости устойчивости животного к стрессорному воздействию от активности NO-ергической системы [9]. Полученные нами данные согласуются с современными представлениями о том, что нитроксидергическая система ограничивает стресс-реакцию и повышает адаптацию организма к факторам стресса [5].
Показано, что оксид азота также играет важную физиологическую роль нейротрансмиттера в ЦНС [18]. В проведенном исследовании мы наблюдали тенденцию к более длительной активности низкоустойчивых крыс во время стрессирования, что, вероятно, связано с развитием выраженного тревожного эмоционального состояния [10]. У животных с блокадой синтеза оксида азота во время иммобилизационно-болевого воздействия общее время двигательной активности было достоверно ниже: у высокоустойчивых – к 24 часам стрессирования, у низкоустойчивых – уже к 12 часам, что может свидетельствовать о более быстром истощении гомеостатических механизмов вследствие стрессорного воздействия и развивающейся гиперкатехоламинемии. По мнению некоторых авторов [2, 17], данный эффект возможно связан с изменением соотношения биогенных аминов мозга вследствие способности оксида азота модулировать высвобождение возбуждающих и тормозных нейромедиаторов [3].
В представленном исследовании неселективная блокада NO-синтаз во время стрессирования приводила к гибели крыс преимущественно группы низкоустойчивых к стрессу. Вероятно, это связано с генетически обусловленным уровнем активности стресс-лимитирующих систем, определяющих индивидуальную устойчивость организма к воздействию стрессорных факторов [7].
Выводы
1. У высокоустойчивых животных иммобилизационно-болевой стресс приводил к увеличению уровня среднего артериального давления через 6 ч – на 7,8 %, 12 ч – на 9,6 %, 24 ч – на 16,1 %; у низкоустойчивых данный показатель увеличился к 6 ч на 7,3 %, к 12 ч – на 9,8 % и далее практически не изменялся. Общее время активности низкоустойчивых крыс было несколько больше по сравнению с высокоустойчивыми: за 12 часов стрессирования – на 11,1 %, за 24 ч – на 16,4 %. Интенсивность движений во время стрессирования заметно не различалась.
2. На фоне блокады синтеза оксида азота у высокоустойчивых самок уровень среднего артериального давления через 24 ч иммобилизационно-болевого воздействия уменьшался на 8,9 %; у низкоустойчивых – на 14,2 % уже через 6 часов стрессирования, впоследствии артериальное давление у этих животных не определялось и они погибали. Общее время активности и интенсивность движений как высоко-, так и низкоустойчивых к стрессу животных с дефицитом оксида азота было меньше по сравнению с контрольной группой.
3. Введение ингибитора NO-синтаз L-NAME до и во время стрессирования вызывало гибель значительной части низкоустойчивых крыс (7 из 8 животных), тогда как у высокоустойчивых погибла только одна.