Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,564

SINTHESIS OF 9-METHOXY-10-SUBSTITUTED 5-DEAZAFLAVINS, BENZO [B]PYRIMIDO[5,4-G][1,8]NAPHTHYRIDINE-2,4-DIONES ON THE BASIC OF 6-AMINOURACILS AND STUDY OF BIOLOGICAL ACTIVITIES

Melik-Ohanjanyan R.G. 1 Hovsepyan T.R. 1 Karakhanyan G.S. 1 Israyelyan S.G. 1 Arsenyan F.G. 1 Nersesyan L.E. 1 Aharonyan A.S. 1
1 The Scientific and Technological Centre of Organic and Pharmaceutical Chemistry NAS RA A.L. Mnjoyan Institute of Fine Organic Chemistry
1474 KB
By annulation reaction of 6-aminouracils with 2,3-dimethoxybenzadehyde and 2-chloro-7-methyl(methoxy)quinoline-3-carbaldehydes the new 9-methoxy-10-substituted 5-deazaflavins-pyrimido[4,5-b]quinolie-2,4(3H,10H)diones and 9,12-substituted benzo[b]pyrimido[5,4-g][1,8]naphthyridin-2,4-diones were synthesized. Their antitumor properties on sarcoma 180 model were studied. For the comparative evaluation of biological activity also studied the impact of these heterocyclic systems on the level of methylation of tumor DNA in vitro conditions on sarcoma 180 model. According to obtained dates the most of the studied substances causes a marked inhibition of methylation level of tumor DNA. Some correlation between in vitro and in vivo dates determined.
6-aminouracil
annulation
5-deazaflavin
1,8-naphthyridine
tumor DNA
sarcoma 180

Возрастающий интерес к созданию новых производных 5-деазафлавина-пиримидо [4,5-b]хинолин-2,4(3H,10H)диона обусловлен тем, что они признаны как новый класс таргетно действующих противоопухолевых агентов, обладающих широким спектром ингибирующей активности в отношении ряда опухолевых штаммов [4, 6]. Продолжая ранее начатые исследования по изысканию новых эффективных противоопухолевых средств среди производных 5-деазафлавина и бензо[b]пиримидо[5,4-g[1,8] нафтиридина[1,2] в настоящей работе осуществлен синтез ряда новых производных названных гетероцикли- ческих систем, изучены их противоопухолевые свойства и воздействие на уровень метилирования опухолевой ДНК. Синтез проведен по схеме (рисунок).

С целью уточнения роли заместителя в положении 10 на биологическую активность 9-метокси-5-деазафлавина в качестве исходных соединений были выбраны различные 6-алкил-, фенил-, бензиламинозамещенные урацилы 1а-е, полученные обработкой 6-хлорурацила соответствующими алкил- или ариламинами [1,4,6]. Циклоконденсация последних с 2,3-диметоксибензальдегидом по разработанному нами методу привела к намеченным 5-деазафлавинам 3а-е [1,2]. Реакцией аннелирования тех же 6-аминозамещенных урацилов 1а-е 2-хлор-7-метил(или метокси)хинолин-3-карбальдегидами, синтезированными методом Вильсмеера [8], получены 12-или 9,12-замещенные бензо[b]пиримидо[5,4-g[1,8]нафтиридин-2,4-дионы 5а-е. Последние представляют интерес в качестве структурной основы многих биологически активных соединений [6,7]. Гетероциклизация протекает при кипяченни 6-аминозамещенных урацилов 1а-е с альдегидами 4а-с в ДМФА в течение 8-10 ч.

melik1.tif

1,3a-e, R=Me(a), (CH2)3 OH(b), Ph(c), C6H3-2-OH-5-CH3(d),Bn(e). 4a-c, =H(a), R’=CH3(b), R’=ОCH3(с). 5a-e, R=(CH2)3OH,R’=H(a); R=Bn, R’=H(b); R=Me, R’=9-Ме(с); R=(CH2)3OH, R’=9-Me(d); R=Ph, R’=9-OMe (e)

Чистота и строение синтезированных соединений подтверждены методами ТСХ, ЯМР1Н и элементным анализом.

Экспериментальная химическая часть

Спектры ЯМР 1H регистрировали на спектрометре Varian Mercury-300VX с рабочей частотой 300 МГц, внутренний стандарт – ТМС. Температуры плавления определяли на микронагревательном столике «Boetius 72/2064». Ход реакций контролировали методом ТСХ на пластинках Silufol UV-254 в системах хлороформ–этанол, 4:1 или диоксан–бензол, 3:1, проявление УФ облучением.

9-Метокси-10-замещенные 5-деазафлавины 3а-е описаны нами в работе [2].

Тетрагидробензо[b]пиримидо[5,4-g][1,8]нафтиридин-2,4-дионы(5а-е). Общая методика. Смесь 1ммоль соответствующего урацила 1а-е, 1ммоль 2-хлорхинолин-3- или 2-хлор-7-метил(метокси)хинолин-3-карбальдегида 4 в 20 мл ДМФА кипятят 8-10 ч. Конец реакции контролируют методом ТСХ. Отгоняют растворитель, твердый остаток дважды промывают метанолом, затем диэтиловым эфиром и сушат на воздухе.

12-(3-Гидроксипропил)-2,3,4,12-тетрагидробензо[b]пиримидо[5,4-g][1,8]нафти- ридин-2,4-дион(5а). Выход 47 %, т.пл. > 360 °С. Спектр ЯМР1H, б, м.д.: 1.95-2.05 м (2Н, CH2), 3.58 тд. (2Н,CH2ОН,J1, 6.4, J2 5.2 Гц), 4.58 т (1Н, ОН, J 5.2 Гц), 4.91 т (2Н, NCH2, J 7.0 гц), 7.65 дд (1Наром., J1 9.0, J2 2.4 Гц), 7.95-8.21 м (3Наром.), 9.03 с (1Н,=СН), 9.15 с (1Н, =СН), 11.21 уш.с (1Н, NH). Найдено, %: С 63.57; Н 4.62; N 17.38. C17 H14 N4 O3. Вычислено, %: C 63.34; H 4.37; N 17.38.

12-Бензил-2,3,4,12-тетрагидробензо[b]пиримидо[5,4-g][1,8]нафтиридин-2,4-дион (5b). Выход 52 %, т.пл. 346–347 °С. Спектр ЯМР1H, б, м.д.: 6.08 с (2Н, NCH2), 7.21-7.48 м (5Наром.), 7.65 т (1Наром.), 7.91-8.08 м (2Наром), 8.18 д (1Наром., J 9.1 Гц), 9.07 с (1Н,=СН), 9.24 с (1Н,=СН), 11.27 уш.с (1Н, NH). Найдено, %: С 71.33; Н 3.64; N 15.53. C21 H14 N4 O2. Вычислено, %: C 71.17; H 3.98; N 15.81.

9,12-Диметил-2,3,4,12-тетрагидробензо[b]пиримидо[5,4-g][1,8]нафтиридин-2,4-дион (5с). Выход 71 %, т.пл. 343–345 °С. Спектр ЯМР1H, б, м.д.: 2.59 с (3Н, CH3), 4.03 с (3Н, NCH3), 7.42 дд (1Наром., J1 9.1,J2 2.4 Гц), 7.80-8.29 м (2Наром.), 9.02 с (1Н, =СН), 9.21 с (1Н, =СН). ). Найдено, %: С 65.47; Н 7.39; N 19.02. C16 H12 N4 O2. Вычислено, %: C 65.74; H 7.58; N 19.16.

9-Метил-12-(3-гидроксипропил)-2,3,4,12-тетрагидробензо[b]пиримидо[5,4-g] [1,8]нафтиридин-2,4-дион (5d). Выход 63 %, т.пл > 360 °С. Спектр ЯМР1H, б, м.д.: 1.92-2.03 м (2Н, CH2), 2.59 с (3Н, CH3), 3.55 тд (2Н, CH2ОН, J1 6.4, J2 5.2 Гц), 4.61 т (1Наром., J1 9.0,J2 2.4 Гц), 4.91 т (2Н, NСН2,J 7.0 гц), 7.51 дд (1Наром., J1 9.0,J2 2.4 гц), 7.85 д (1Наром., J2.4 гц), 8.09 д (1Наром., J 9.0 Гц), 9.02 c (1Н, =СН), 9.18 с (1Н, =СН), 11.21 уш.с. (1Н, NН). Найдено, %: С 64.35; Н 5.41; N 16.37. C18H16N4O3. Вычислено, %: C 64.08; H 5.07; N 16.60.

9-Метокси-12-фенил-2,3,4,12-тетрагидробензо[b]пиримидо[5,4-g][1,8]нафтири-дин-2,4-дион (5е). Выход 65 %, т.пл > 300 °С. Спектр ЯМР1H, б, м.д.: 3.90 с (3Н, ОСН3), 6.89 д (1Наром., J 2.0 Гц), 7.25 дд (1Наром., J1 9.0,J2 2.0 Гц), 7.32-7.65 м (5Наром), 8.09 д (1Наром., J 9.0 Гц), 9.09 с (1Н, =СН), 9.15 с (1Н, =СН), 11.17 с (1Н, NН). Найдено, %: С 68.35; Н 3.57; N 15.32. C21 H14 N4 O3. Вычислено, %: C 68.10; H 3.81; N 15.13.

Экспериментальная биологическая часть

Уровень метилирования ДНК определяли на модели перевиваемой опухоли мышей саркоме 180, извлеченной после забоя животных методом передозировки эфирного наркоза. К опухолевому гомогенату добавляли 3х10-6 М раствора исследуемых веществ (на 10г опухоли 12,5мл раствора). В качестве растворителя использовали 0,5 % раствор карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ). После инкубации в термостате при 37оС, в течение 24 ч экстрагировали ДНК фенольно-хлороформенным методом [9], затем осуществляли кислотный гидролиз ДНК до азотистых оснований: гуанин (Г), цитозин (Ц), 5-метилцитозин (5МЦ), аденин (А), тимин (Т). С помощью тонкослойной хроматографии в растворителе н-бутанол:вода:аммиак (60:10:0,1) проводили спектрофотометрию элюатов всех оснований.

Противоопухолевую активность 9-метокси-10-замещенных 5-деазафлавинов 3а-е и бензопиримидонафтиридинов 5а-е изучали на модели саркома 180 согласно [3]. Соединения вводили животным в виде взвеси в КМЦ в дозе 125 мг/кг, спустя 48 ч после перевивки опухоли, внутрибрюшинно, ежедневно, в течение 6 дней. Контрольные животные в те же сроки эксперимента получали эквивалентный объем растворителя (КМЦ). Через 24 ч после последней инъекции животных забивали, определяли процент торможения роста опухоли по отношению к контролю, согласно общеизвестной формуле [3]. В опытах использовали 70 белых беспородных мышей обоего пола с исходным весом 20-24 г.

Полученные данные обрабатывали статистически согласно методу Стъюдента-Фишера.

Опухолевая ДНК, выделенная в ходе эксперимента, принадлежит к АТ-типу. Количество (Г+Ц+МЦ) в них составляет 41,7-44,2 моль %. Нуклеотидный состав ДНК соответствует правилам Чаргаффа.

Согласно полученным данным, четкое различие между образцами ДНК из опухолевой ткани после воздействия соединений 3а-e и 5a-e обнаруживается только в отношении содержания 5-МЦ. Из приведенных в таблице данных следует, что большинство изученных веществ вызывает заметное ингибирования уровня метилирования опухолевой ДНК. При этом наибольшим деметилирующим действием среди 5-деазафлавинов 3а-е обладали производные, содержащие гидроксипропил-, бензил-, 2,4-замещенный фенил- и фенил- фрагменты в структуре (3b, 3е, 3d, 3с). Они угнетали метилирование ДНК соответственно на 63,3; 58,3; 49,2 и 41,7 % (P < 0,05). Среди бензопиримидонафтиридинов 5а-е относительно эффективными оказались 3-гидроксипропил- и 9,12-диметилзамещенные аналоги 5а и 5с, которые ингибировали уровень метилирования ДНК соответственно на 50,8 и 45,8 % (P < 0,05). Деметилирующая способность соединений может быть обусловлена их влиянием на аномально метилированные гены, приводящие к торможению роста опухоли [5].

Нуклеотидный состав опухолевой ДНК

Соединение

Содержание оснований в ДНК, мол. %

Угнетение уровня метилирования, %

Г

Ц

5-МЦ ± ς

А

Т

Г+Ц+5-МЦ

Саркома 180

21,81

20,61

1,20 ± 0,03

28,19

28,19

43,62

 

20,85

19,85

1,00 ± 0,02 P < 0,05

29,15

29,15

41,7

-

3b

21,98

21,54

0,44 ± 0,02 P < 0,05

28,02

28,02

43,96

63,3

21,15

20,45

0,70 ± 0,04 P < 0,05

28,85

28,85

42,3

41,7

3d

21,31

20,70

0,61 ± 0,03 P < 0,05

28,69

28,69

42,62

49,2

21,47

20,97

0,50 ± 0,05 P < 0,05

28,53

28,53

42,94

58,3

22,06

21,47

0,59 ± 0,04 P < 0,05

27,94

27,94

44,12

50,8

5b

21,58

20,56

1,02 ± 0,05 P < 0,05

28,43

28,43

43,16

15

21,59

20,94

0,65 ± 0,01 P < 0,05

28,41

28,41

43,18

45,8

5d

21,61

20,75

0,86 ± 0,02 P < 0,05

28,39

28,39

43,22

28,3

21,99

20,89

1,10 ± 0,02 P < 0,05

28,01

28,01

43,98

-

В химиотерапевтических экспериментах некоторые производные 5-деазафлавина 5а-е и бензопиримидонафтиридина 5а-е проявили слабую или умеренную противоопухолевую активность в отношении саркомы 180, угнетая ее рост на 32-50 % (P < 0,05). При сравнительной оценке полученных результатов установлена некоторая корреляция между in vitro и in vivo данными. Так, 3-гидроксипропилзамещенный аналог 5-деазафлавина (3b), обладающий выраженным деметилирующим действием в опытах in vitro (63,3 %), в in vivo условиях также проявляет наибольшую противоопухолевую активность (ингибирование роста саркомы 180 на 50 %, P < 0,05). Аналогичным образом соединение 3е с относительно меньшим деметилирующим действием (58,3 %), обладало слабой терапевтической активностью (торможение роста опухоли на 30,5 %, P < 0,05). В отличие от прозводных 5-деазафлавина аналоги бензопиримидонафтиридинов с умеренными деметилирующими свойствами (5а и 5с) в химиотерапевтических опытах не проявили достоверное противоопухолевое действие.

Выводы

На основе полученных результатов можно сделать следующие выводы:

Осуществлен синтези новых 9,12-замещенных бензо[b]пиримидо[5,4-g][1,8]нафтиридин-2,4-дионов. Изучением протовоопухолевых свойств описанных соединений и их воздействия на уровень метилирования опухолевой ДНК в условиях in vitro показано, что большинство из них проявляют значительное ингибирование уровня метилирования опухолевой ДНК и слабую или умеренную противоопухолевую активность. Установлена корреляция методу in vitro и in vivo данными, что указывает на перспективность поиска более эффективных соединений в этих рядах.