Известно, что естественный гликозаминогликан крови – гепарин проявляет антикоагулянтную активность вследствие блокады свертывающей активности тромбина и других коагуляционных белков организма, нормализует уровень холестерина и сахара в крови и увеличивает скорость заживления ран в организме [2].
Гепарин взаимодействует через свои сульфатные и карбоксильные группы с различными аминокислотами, пептидами, белками с образованием комплексных соединений. Введение животным этих соединений с некоторыми аминами и другими низкомолекулярными веществами приводило к повышению антикоагулянтной активности крови, значительно превышающей ее эффект, достигаемый при введении эквивалентной по отношению к комплексу дозы гепарина [5].
В настоящее время еще нет достаточно определенных данных о механизмах действия комплексных соединений гепарина с низкомолекулярными лигандами в проявлении антитромбоцитарных, антикоагулянтных и фибринолитических эффектов плазмы крови в организме. Предполагается, что они способны действовать в кровотоке как прямо, так и опосредованно, т.е. оказывать свои эффекты через взаимодействие с рецепторами [8]. Известно, что такие лекарства, как никотиновая кислота и аспирин участвуют в снижении агрегации тромбоцитовза счет уменьшения образования тромбоксана А2 (никотиновая кислота) или ингибирования циклооксигеназы (аспирин) [6]. Никотиновая кислота включается в простетическую группу ферментов, являющихся переносчиками водорода: никотинамидадениндинуклеотида (НАД) и никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ), регулирует окислительно-восстановительные процессы, тканевое дыхание, синтез белков и жиров, распад гликогена. Угнетает липолиз в жировой ткани, уменьшает скорость синтеза ЛПОНП. Нормализует липидный состав крови: снижает уровень общего холестерина, ЛПНП, триглицеридов и повышает уровень ЛПВП, обладает антиатерогенными свойствами. Оказывает сосудорасширяющее действие, в т.ч. на сосуды головного мозга, улучшает микроциркуляцию, повышает фибринолитическую активность крови [7].
Учитывая возможность проявления вазоактивного действия аспирина и никотиновой кислоты через комплексообразование с гепарином, они могут проявить защитное противотромботическое лействие в процессах тромбоцитарного и плазменного гемостаза, что имеет немаловажное значение в предупреждении нарушений системы свертывания крови.
В то же время известно, что сердечно-сосудистые заболевания зачастую сопровождаются предтромбозами, приводящими в последующем к тромбозам [1, 3].
Применение отдельных лекарственных веществ разнонаправленного действия – антикоагулянтного, антиагрегантного или фибринолитического при сердечно-сосудистых заболеваниях, хотя и оказывает положительное влияние на состояние системы гемостаза, но при передозировках может привести к нежелательному явлению [9].
Цель работы заключалась в исследовании антикоагулянтно-фибринолитичесих эффектов соединения гепарина с аспирином и никотиновой кислотой in vitro и при его применении человеку для коррекции нарушений гемостаза при ишемической болезни сердца.
Материалы и методы исследования
В работе использовали препараты отечественного производства – высокомолекулярный гепарин (Г) (учитывая, что одно его монозвено имеет мол.массу 600 D), аспирин (А) и никотиновую кислоты(НК). Готовили препарат из трех перечисленных ингредиентов (ГАНК) в молярном соотношении, равном 4.8:1.3:1.0. В условиях in vitro при разных разведениях соединения ГАНК (от 10-7 до 10-1 М) определяли антикоагулянтную по тесту АЧТВ и фибринолитическую (суммарную, неферментативную) активность на пленках нестабилизированного фибрина, а также активность тканевого активатора плазминогена (ТАП).
В условиях in vivo внутривенно вводили препараты (опыт – тройное соединение ГАНК в дозе 1.5 мг/кг массы тела и контроль 1 – гепарин, контроль 2 – никотиновая кислота, контроль 3 – аспирин, контроль 4 – 0.85 %-ый физиологический раствор в дозах, эквивалентных их содержанию в соединении)) 30 здоровым животным (белым лабораторным крысам-самцам с массой тела 180-200 г). Все исследования проводили в соответствии с этическими принципами и документами, рекомендованными Европейским научным фондом о гуманном отношении к животным.
Таблица 1
Антикоагулянтная активность (по тестам АЧТВ и ТВ), суммарная фибринолитическая активность (СФА), фибриндеполимеризационная активность (ФДПА), активность тканевого активатора плазминогена (ТАП) у здоровых крыс через 10 мин после внутривенного введения им соединения гепарина с аспирином и никотиновой кислотой в дозе 1.5 мг/кг массы тела (M ± m)
|
Условия эксперимента |
АЧТВ, с |
СФА, мм2 |
ФДПА, мм2 |
ТАП, мм2 |
|
Опыт – Введение соединения ГАНК |
46.0 ± 2.0** (140 %) |
50.0 ± 3.0** (138 %) |
38.3 ± 2.6** (170 %) |
21.5 ± 0.9** (148 %) |
|
Контроль 1 – введение гепарина |
39.6 ± 0.7* (120 %) |
38.0 ± 2.4 (106 %) |
24.5 ± 0.5 (110 %) |
19.8 ± 2.8* (137 %) |
|
Контроль 2 – никотиновая кислота |
35.1 ±1.9 (106 %) |
38.7 ± 5.0 (107 %) |
27.4 ± 1.1* (124 %) |
16.5±0.6 (114 %) |
|
Контроль 3 – аспирин |
34.0 ± 0.9 (103 %) |
39.4 ± 1.7 (109 %) |
29.3 ± 2.4* (132 %) |
15.8 ± 3.0 (108 %) |
|
Контроль 4 – 0.85 %-ый NaCl |
33.0 ± 1.3 (100 %) |
36.0 ± 2.3 (100 %) |
22.1 ± 1.5 (100 %) |
14.4 ± 1.7 (100 %) |
Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля 4 (0.85 %-ый NaCl), принятых за 100 %. Обозначения: **р < 0,01; *р < 0,05.
Таблица 2
Изменение антикоагулянтной активности (по тестам АЧТВ и ТВ), суммарной фибринолитической активности (СФА), фибриндеполимеризационной активности (ФДПА), активности тканевого активатора плазминогена (ТАП) у больных ИБС на фоне перорального приема соединений гепарина с аспирином и никотиновой кислотой (M ± m)
|
Группы |
АЧТВ, с |
ТВ, с |
СФА, мм2 |
ФДПА, мм2 |
ТАП, мм2 |
|
Доноры (здоровые) |
36.0 ± 2.0 |
21.4 ± 0.9 |
50.0 ± 3.0 |
15.5 ± 2.6 |
9.5 ± 0.9 |
|
Больные ИБС – до лечения |
28.1 ± 1.7 (100 %) |
15.4 ± 0.9 (100 %) |
35.0 ± 2.4 (100 %) |
12.5 ± 0.5 (100 %) |
9.8 ± 2.8 (100 %) |
|
Больные ИБС– после лечения |
37.0 ± 0.9** (131 %) |
19.5 ± 0.1** (127 %) |
58.7 ± 5.8** (167 %) |
38.3 ± 2.4** (300 %) |
26.5 ± 0.6** (170 %) |
Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб «до лечения», принятых за 100 %.
В последующем препарат ГАНК вводили 18 больным (10 мужчин и 8 женщин) ишемической болезнью сердца (ИБС) перорально. Разовая лечебная доза препарата составляла 110 мг/70 кг массы тела. При наблюдениях за больными соблюдали этические принципы Хельсинской декларации и информированное согласие больного Схема лечения больных ишемической болезнью сердца (ИБС) предусматривала прием комплексного препарата 2 раза в сутки до еды в течение 10 суток. Кровь на анализы брали из локтевой вены до лечения и спустя 10 суток после приема комплексных препаратов. В качестве контроля использовали донорскую венозную кровь здоровых людей. Кровь подвергали центрифугированию в течение 12 мин при 3000 g для получения бедной тромбоцитами плазмы. В плазме крови определяли антикоагулянтную активность по тестам АЧТВ и тромбинового времени (ТВ) на анализаторе АСКа 201-Астра; суммарную (СФА) и фибриндеполимеризационную активность (ФДПА), активность тканевого активатора плазминогена (ТАП) [41].
Статистическая обработка данных проведена согласно методу Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
В условиях in vitro при разных концентрациях соединения ГАНК от 10-5М до 10-1М выявлена его антикоагулянтная активность, которая повышалась на 20-25 % по сравнению с контролем (добавление к нормальной плазме крови 0.85 %-ного NaCl) и соответствовала антикоагулянтному действию эквивалентной дозы Г. Наряду с этим впервые была установлена ФДПА у соединения ГАНК при его концентрациях в системе от 10-3М до 10-1М (зоны лизиса на нестабилизированном фибрине составляли при этом 45 ± 2.2 мм2). Эта активность практически отсутствовала у составных частей препарата. В условиях in vitro нами также было показано, что препараты ГАНК ингибируют активность тромбина на 18-20 %.
В экспериментах на здоровых крысах-самцах с массой тела 180-200 г через 10 мин после внутривенного введения ГАНК (т.е. при поступлении препарата непосредственно в кровоток) установлено достоверное повышение антикоагулянтной активности на 40 %, СФА – на 38 %, ФДПА – на 70 %, ТАП – на 48 % по сравнению с контрольными пробами (0.85 %.-ый NaCl). В контрольных образцах после введения эквивалентной дозы Г повышалась антикоагулянтная активность в значительно меньшей степени – на 20 % и активность ТАП – на 37 %, после введения НК и А увеличивалась ФДПА на 24 – 32 % соответственно (табл. 1).
При исследовании крови больных ИБС отмечено угнетение функции противосвертывающей системы, на что указывало повышение свертываемости крови по тестам АЧТВ и ТВ, снижение фибринолиза по тестам СФА, ТАП и низкий уровень ФДПА по сравнению с теми же показателями в крови здоровых людей (табл. 2).
После 10-суточного приема препарата ГАНК у больных отмечалось не только восстановление до нормального уровня, но даже превышение антикоагулянтной активности на 27-31 % по тестам ТВ и АЧТВ соответственно. Достоверное удлинение при этом показателей ТВ свидетельствовало о способности гепариновых соединений, как и самого гепарина [10], ингибировать активность тромбина. На фоне приема комплексов в крови больных повышались СФА – на 67 %, ФДПА – на 200 % раз и активность ТАП – на 170 %.
Заключение
Установлено, что комплексный препарат гепарин-аспирин-никотиновая кислота, обладая фибриндеполимеризационным и антикоагулянтно-фибринолитическим действием in vitro и in vivo, способен оказать защитное действие на организм больных ишемической болезнью сердца от развития тромботических осложнений. В перспективе комплексные соединения гепарина могут быть применены при нарушениях свертываемости крови, сопровождающихся процессами тромбообразования.