Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Распространенность жировой болезни печени неуклонно возрастает во всем мире. В связи со сложностью разграничения этиологических факторов, приведших к данной патологии, и сходстве гистологических изменений в ткани печени в 2011 г. был предложен термин «метаболический синдром – ассоциированная жировая болезнь печени» [11]. В патогенезе алкогольной (АЖБП) и неалкогольной (НАЖБП) жировой болезни печени, в рамках метаболического синдрома прослеживается общность звеньев. Это, прежде всего, активация перекисного окисления липидов (ПОЛ), окислительный стресс, поражение фосфолипидов мембран митохондрий, нарушение системного и клеточного звеньев липидного обмена. Это объясняет сложности в процессе дифференциальной диагностики, поскольку, как данные осмотра, анкетирования, биохимических, так и инструментальных методов исследования, включая биопсию печени, на уровне стеатоза печени дают сходные результаты, не позволяя достоверно высказаться об этиологии процесса [3, 6].

Тем не менее, информация о генезе жировой болезни печени является важной для определения тактики ведения пациента (включая необходимость наблюдения наркологом в случае АЖБП), акцентов в терапии, прогноза заболевания.

Гипотеза настоящего исследования состояла в том, что алкоголь и его метаболит – ацетальдегид являются универсальными мембранотропными соединениями [9], поэтому подход, позволяющий выявить это токсическое действие на уровне мембран и клеток в целом, окажется полезным в плане дифференциальной диагностики жировой болезни печени алкогольного и неалкогольного генеза.

Накопленные в литературе данные свидетельствуют, что эритроцит является высокочувствительной клеткой к воздействию со стороны внешних и внутренних факторов, в ответ на которые наступают глубокие изменения, коренным образом трансформирующие электрические и вязкоупругие характеристики клетки в целом [7, 10]. Проведенными нами ранее исследования позволили сделать вывод, что исследование клеток красной крови методом диэлектрофореза [2] перспективно в отношении определения степени фиброза печени [5], этиологии процесса [4], тяжести заболевания, наличия осложнений [1].

Цель работы – оценить возможности метода диэлектрофореза эритроцитов в дифференциальной диагностике алкогольной и неалкогольной жировой болезни печени.

Материалы и методы исследования

Обследовано 80 пациентов с жировой болезнью печени различного генеза (средний возраст 56,2 ± 1,1 года), из них 42 женщины, 38 мужчин, которые были разделены на две группы в зависимости от этиологии стеатоза печени. Диагноз был верифицирован на основании клинического, биохимического и инструментальных исследований, включая ультрасонографическое, непрямую эластометрию, а также анкеты по потреблению алкоголя, уровню тревоги, отношению к образу жизни. Первую группу составили 28 пациентов (35 %) с наличием алкогольной жировой болезни печени (АЖБП), вторую группу – 52 больных (65 %) с признаками неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП).

Критериями включения в исследование являлись: 1. наличие мужчин и женщин 25-70 лет с жировой болезнью печени или факторами ее риска (злоупотребляющих алкоголем, имеющих ИМТ или ожирение, нарушения липидного обмена, инсулинорезистентность и др.); 2. подписание информированного согласия на участие в исследовании.

Группу сравнения (третья группа) составили практически здоровые обследуемые (20 человек – 12 женщин, 8 мужчин, средний возраст 54,7 ± 1,3 года), ведущие здоровый образ жизни и употребляющие алкоголь не чаще 1-2-х раз в месяц в умеренных дозах, у которых при клиническом, лабораторном и инструментальном обследовании не выявлено признаков заболевания печени и другой патологии внутренних органов.

Обследование выполнено с одобрения Комитета Биомедицинской Этики ФГБНУ «НИИТПМ» (протокол от 28.02.2015). Все обследуемые заполняли стандартные анкеты: 1) информированное согласие пациента на участие в обследовании; 2) стандартную анкету о частоте и дозах потребляемого алкоголя – CAGE-опросник, AUDIT (для выявления алкогольного генеза стеатоза); 3) анкету по выявлению патологии желудочно-кишечного тракта; 4) анкету по образу жизни.

В условиях клиники НИИТПМ пациентам были выполнены следующие инструментальные исследования: УЗИ органов брюшной полости, ЭКГ, непрямая эластометрия печени (НЭМ), у части пациентов выполнена компьютерная томография.

Проведены исследования общего анализа крови, мочи, биохимического исследования крови с акцентом на печеночные пробы, показатели метаболического синдрома, исследование маркеров вирусных гепатитов.

Для проведения исследования эритроцитов методом диэлектрофореза в неоднородном переменном электрическом поле (НПЭП) клетки красной крови получали из цельной крови пациентов, взятой из вены. Подробно методика описана в монографии [2]. Для компьютерной обработки данных использовался пакет оригинальных программ CELLFIND. Ошибка воспроизводимости метода – 7-12 %.

Статистическая обработка данных выполнена с использованием программы SPSS, ver. 17. Определялся характер распределения количественных признаков методом Колмогорова-Смирнова. В случае нормального распределения вычислялось среднее значение (М) и стандартная ошибка среднего (m). Достоверность различия показателей оценивали по критериям Стьюдента, Пирсона (при нормальном распределении), в случаях отклонения распределения от нормального использовались непараметрические критерии (U-критерий Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, хи-квадрат). Связи между признаками оценивались путем вычисления коэффициента корреляции Спирмена (r). Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости нулевой гипотезы (p) принимался равным 0,05. Для оценки значимости параметров эритроцитов с точки зрения дифференциальной диагностики алкогольной и неалкогольной жировой болезни печени был использован ROC-анализ с помощью построения приемных характеристических кривых (ROC-кривые) для различных характеристик клеток красной крови.

Результаты исследования и их обсуждение

При анализе особенностей проявлений жировой болезни печени (ЖБП) в общей группе (80 человек) были выявлены следующие аспекты. Минимальная биохимическая активность процесса отмечена у 38 человек, умеренная – у 42. Лабораторные признаки цитолиза выявлены у 43 % больных ЖБП, уровень сывороточных трансаминаз не превышал трех норм, при этом содержание АЛТ превышало показатель АСТ. У 38 % больных выявлено повышение активности щелочной фосфатазы (не более, чем двукратное) и гамма-глутамилтранспептидазы. Гипербилирубинемия (преимущественно смешанная) в пределах 1,5 N имела место в 32 % случаев. Диспротеинемия различной степени выраженности выявлена у 18 % пациентов. Стадия болезни определялась на основании клинических, биохимических и инструментальных исследований. Ультразвуковое исследование и компьютерная томография позволили верифицировать наличие гепатомегалии у всех пациентов, косвенно оценить степень фиброза печени у большинства обследуемых как умеренную (F2 ст.), признаки формирования портальной гипертензии отсутствовали. Вирусная этиология заболевания исключена на основании отсутствия серологических маркеров методом иммуноферментного анализа (ИФА) и (или) ДНК и РНК вирусов методом полимеразноцепной реакции (ПЦР). Алкогольный генез стеатоза устанавливался по данным достоверно подтвержденного отсутствия или наличия систематического потребления алкоголя в настоящее время и в анамнезе (по данным стандартного опроса, в том числе с помощью CAGE-опросника, AUDIT).

У 59 (73,8 %) пациентов общей группы жировая болезнь печени представляла собой проявление метаболического синдрома. У 67,5 % больных выявлено абдоминально-висцеральное ожирение с ИМТ > 30 кг/м2. Артериальная гипертензия II степени обнаружена у всех обследованных. Сахарный диабет 2-го типа выявлен у 52,5 %, у 18,8 % отмечено наличие нарушения толерантности к глюкозе. У 92,5 % больных было определено наличие инсулинорезистентности. Атерогенная дислипидемия наблюдалась у всех обследованных: в 15 % – ГЛП 2А, 85 % – ГЛП 2Б. У 83,8 % пациентов была выявлена гиперурикемия.

Клинико-инструментальная характеристика групп представлена в табл. 1.

Таблица 1

Клинико-инструментальная характеристика групп обследуемых

Примечание. M – среднее, m – средняя ошибка, * – достоверность (p) отличия от 1-й группы (* – p < 0,05, ** – p < 0,01, *** – p < 0,001, **** – p < 0,0001); ^ – достоверность (p) отличия от 2-й группы (^ – p < 0,05, ^^ – p < 0,01, ^^^ – p < 0,001, ^^^^ – p < 0,0001).

Из данных таблицы следует, что 1-я и 2-я группы достоверно не различались по возрасту. В группе с АЖБП преобладали мужчины, а среди пациентов с НАЖБП было больше женщин. У всех пациентов с НАЖБП стеатоз развился в рамках метаболического синдрома (с проявлениями в виде ожирения, артериальной гипертензии, нарушений углеводного обмена, инсулинорезистентности), лишь у 7 пациентов с АЖБП отмечено наличие элементов метаболического синдрома. Вместе с тем, у пациентов обеих групп наблюдались дислипидемии, причем преобладал ГЛП 2Б тип. Среди пациентов с АЖБП достоверно преобладали курильщики со стажем курения 10,7 + 2,6 года, курящих среди больных с НАЖБП было лишь 7,7 %, причем курили они в среднем 1,02 + 0,58 года. Все пациенты группы с АЖБП употребляли алкоголь в умеренных и токсических дозах (от 80 до 110 г чистого этанола) длительное время (23,1 + 1,7), причем преобладал неблагоприятный в плане развития соматических осложнений хронической алкоголизации стиль потребления алкоголя – 2-4 раза в неделю у 86 % обследуемых, остальные употребляли алкоголь ежедневно. В группе с НАЖБП употребляли алкоголь 9,6 % пациентов, причем в дозах, не превышающих 1-2 дринков 1-2 раза в месяц (длительность потребления 3,62 + 1,1 года).

У всех пациентов по данным УЗИ брюшной полости выявлены признаки жировой болезни печени, по данным непрямой эластометрии преобладающим в обеих группах оказался умеренный фиброз (F2); у 25 % и 29 % больных, соответственно, выявлен F3, но достоверных различий по степени фиброза в группах с АЖБП и НАЖБП не отмечено.

Пациенты обеих группы не различались по наличию и длительности артериальной гипертензии (подтвержденной УЗИ-признаками гипертрофии левого желудочка), инфекциям мочевых путей. Вместе с тем, у больных с АЖБП достоверно чаще наблюдались нарушения ритма и проводимости сердца (р = 0,026), ХОБЛ (р < 0,05), а в группе с НАЖБП – нарушения функции щитовидной железы с преобладанием гипофункции (р = 0,025).

При анализе показателей липидного спектра достоверных различий по уровню общего холестерина между группами не отмечено, уровни триглицеридов и ХС ЛПВП оказались достоверно выше у пациентов с НАЖБП (р < 0,05, р = 0,003, соответственно). Уровни глюкозы крови в группах достоверно не различались.

Наибольшие различия между группами выявлены в отношении уровней показателей печеночных проб. У пациентов с АЖБП выражены проявления синдрома цитолиза, гепатоцеллюлярной недостаточности, холестаза (достоверное повышение уровней трансаминаз с преобладанием АСТ, ГГТП, ЩФ, общего билирубина с повышением уровней обеих фракций), диспротеинмии (повышение уровня тимоловой пробы). Уровни сывороточного железа оказались достоверно выше, чем в группе сравнения, но в подгруппах не различались.

Пациенты с АЖБП имели большие отклонения в уровне мочевой кислоты (р = 0,036), креатинина (р < 0,05) по сравнению с НАЖБП. Это свидетельствует о большей вовлеченности нарушений пуринового обмена, функции почек.

Показатели гемостаза свидетельствуют о наличии признаков избыточного свертывания пристеночного характера на фоне хронических воспалительных процессов в обеих группах без достоверных различий между ними и значимыми отличиями от здоровых обследуемых. Следует отметить, что уровень волчаночного антикоагулянта у пациентов с АЖБП достоверно выше, чем у больных с НАЖБП, что свидетельствует о большей нестабильности клеточных мембран с тенденцией к избыточному свертыванию в данной группе.

Большая часть показателей при исследовании общего анализа крови достоверно не различалась между группами. Однако у больных с АЖБП достоверно выше оказался уровень ретикулоцитов и ниже – СОЭ по сравнению с группой с НАЖБП.

Таким образом, в группе пациентов с АЖБП стеатоз развился на фоне многолетнего употребления алкоголя в неблагоприятном в отношении соматических осложнений стиле, отличался большей биохимической активностью, большей выраженностью нестабильности мембран клеток. У больных с НАЖБП патология печени являлась проявлением метаболического синдрома, что сказывалось на особенностях биохимических параметров; биохимическая активность диффузной патологии печени носила минимальный характер, что не препятствовало прогрессированию фиброза печени (у большинства пациентов он находился на уровне F2-3).

Исследование электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов методом диэлектрофореза

Наблюдения за характером поведения эритроцитов в НПЭП показали, что эритроциты здоровых лиц на частотах 5105 Гц и 106 Гц обнаружили ярко выраженную способность к деформации (рис. 1, a). Они вытягивались и приобретали высокую поступательную скорость в сторону ближайшего электрода. На частотах 5104 Гц, 105 Гц деформации не наблюдалось, клетки отталкивались от электродов (отрицательный диэлектрофорез), единичные клетки под действием поля разрушались.

Рис. 1. Разделение и деформация эритроцитов под действием неоднородного переменного электрического поля на частоте 1 МГц: а – у лиц группы сравнения; б – у больных с НАЖБП (сниженная амплитуда деформации эритроцитов); в – у больных с АЖБП (низкая амплитуда деформации эритроцитов); г – повышенный гемолиз эритроцитов на частоте 106МГц у больных с АЖБП; д – повышенное образование агрегатов у пациентов с АЖБП

У больных с жировой болезнью печени взаимодействие эритроцитов с НПЭП было другим: амплитуда деформации (м) и скорость поступательного движения клеток (мкм/c) относительно электродов на высоких частотах 5105 Гц и 106 Гц были значительно ниже (p < 0,01) (рис. 1, б, в). Избыточный гемолиз клеток наблюдался как на высоких (106 Гц, 5105 Гц) (рис. 1, г), так и на низких частотах (5104 Гц, 105 Гц). Отмечалась также повышенная способность эритроцитов к образованию агрегатов крупных и средних размеров после перевода эритроцитов в раствор 0,3М сахарозы (p < 0,02) (рис. 1, д).

Выявлены различия в поведении эритроцитов, связанные с генезом жировой болезни печени. Эритроциты пациентов с НАЖБП после перевода в раствор сахарозы преимущественно имели дискоцитарную форму, 13,5 % клеток приобретали форму «спущенного мяча» или сфероцитарную. Уровень недискоцитарных форм у больных с АЖБП возрастал до 32,1 % (p = 0,046), кроме того, большая часть клеток отличалась бугристой, шиповидной поверхностью (78,6 % против 46,2 %, р = 0,029), что отражает выраженный дефицит внутриклеточных макроэргических соединений, связанный с воздействием этанола [7, 8, 9].

Эритроциты пациентов с АЖБП имели более низкий поверхностный заряд по сравнению с клетками красной крови больных с НАЖБП, что отражали более низкие уровни скорости движения к электродам, величина дипольного момента. Данное обстоятельство, очевидно, связано со снижением уровня сиаловых кислот, определяющих заряд клетки, на поверхности эритроцитов под действием этанола, оседания на мембранах крупномолекулярных белков из сыворотки крови в связи с выраженностью диспротеинемии при алкогольном поражении печени [6, 9, 10]. При алкогольной жировой болезни печени способность клеток к деформации оказалась достоверно ниже, чем при неалкогольном генезе заболевания. Причем, низкие амплитуды деформации отмечены на всех частотах. Доля лиц, имеющих минимальную пластичность при алкогольном генезе, оказалась максимальной (92,9 % против 42,3 % в группе с НАЖБП, p < 0,0001). Низкая деформабельность при АЖБП отмечена на фоне максимально высоких обобщенных показателей вязкости (r = – 0,69, p = 0,002) и жесткости (r = – 0,74, p < 0,001). Большие изменения пластичности клеток при алкогольном генезе заболевания, вероятно, связаны как с большими структурными сдвигами в мембранах под действием этанола (в том числе, появление аномальных фосфолипидов, этиловых эфиров жирных кислот), так и с изменением в структуре гемоглобина, появлению «сшивок» между ним и внутренней структурой мембран [2, 7, 8]. Увеличение относительного содержания холестериновой фракции, насыщенных жирных кислот и более низкий уровень общих липидов и фосфолипидов, триглицеридов, эфиров холестерина и ненасыщенных жирных кислот в мембранах эритроцитов, приводящих к снижению деформабельности, происходит как при АЖБП, так и при НАЖБП, и определяется выраженными сдвигами липидного профиля сыворотки крови [2, 6].

Мембраны клеток красной крови при алкогольном генезе жировой болезни печени имели тенденцию к более высокой электропроводности, большей толщине по сравнению с больными с НАЖБП, что определяется мембранотоксичностью этанола, ацетальдегида, которые усугубляют воздействие на мембраны клеток свободных жирных кислот [3, 6, 9].

Наличие выраженного токсического компонента в виде этанола отражалось в большем смещении равновесной частоты в высокочастотный диапазон при АЖБП по сравнению с НАЖБП (р=0,029). Данное обстоятельство еще в большей степени повлияло на показатель поляризуемости, отражающей жизнеспособность клеток. Он оказался достоверно ниже при АЖБП по сравнению с НАЖБП (p < 0,0001). Подобные сдвиги отражают «хрупкость» клеток, склонность их к деструкции при воздействии стрессов различной интенсивности. Повышенный гемолиз эритроцитов выявлялся на разных частотах (модели стресса различной интенсивности) как у пациентов с АЖБП, так и НАЖБП, но выраженность лизиса была большей при алкогольном генезе. Достоверные различия в уровне индекса деструкции выявлены на высокой частоте 106Гц (p < 0,05).

Различия в вязкоупругих и электрически характеристиках эритроцитов у больных с алкогольной и неалкогольной жировой болезнью печени представлены в табл. 2.

Таблица 2

Вязкоупругие и электрические характеристики эритроцитов у больных с жировой болезнью печени различного генеза и в группе сравнения (M ± m)

Примечание. M – среднее, m – средняя ошибка, * – достоверность (p) отличия от 1-й группы (* – p < 0,05, ** – p < 0,02, *** – p < 0,001, **** – p < 0,0001); ^ – достоверность (p) отличия от 2-й группы (^ – p < 0,05, ^^ – p < 0,02, ^^^ – p < 0,001, ^^^^ – p < 0,0001). Величина дипольного момента рассчитывалась при напряженности электрического поля 8,85.10-12Ф/м.

Дифференцирующими параметрами вязкоупругих и электрических свойств эритроцитов между пациентами с алкогольной и неалкогольной жировой болезнью печени оказались: средний диаметр эритроцита, амплитуда деформации при частоте 106Гц, степень деформации при 0,5х106Гц, обобщенные показатели вязкости и жесткости, поляризуемость при частоте 106Гц, величина дипольного момента (р < 0,0001-0,001). В меньшей степени достоверности различают стеатоз различного генеза – преобладание диско- или сфероцитарных форм, наличие бугристых, шиповидных клеток, индекс деструкции клеток при частоте 106Гц, положение равновесной частоты, скорость движения клеток к электродам (р < 0,02-0,05).

Таким образом, пациенты с алкогольной жировой болезнью печени отличались от больных с неалкогольной жировой болезнью печени эритроцитами большего размера с низкой деформабельностью при стрессах различной интенсивности на фоне высоких обобщенных показателей вязкости и жесткости, с низкой жизнеспособностью и склонностью к деструкции при высоких нагрузках, имеющие низкий поверхностный заряд с признаками токсического воздействия.

Данные анализа корреляций вязкоупругих параметров эритроцитов с данными клинико-инструментального, биохимического обследования пациентов представлен в табл. 3. Установлены ассоциации характеристик клеток красной крови с алкогольным и неалкогольным генезом жировой болезни печени, стилем потребления алкоголя, показателями синдрома цитолиза, холестаза. Выявлено также прямые корреляции индекса агрегации при 106Гц с уровнем ретикулоцитов (r = + 0,826, p = 0,011), уровнем волчаночного антикоагулянта (r = + 0,77, p = 0,03) и обратные – с уровнем поляризуемости на частоте 106Гц (r = – 0,377, p = 0,002).

Таблица 3

Корреляции вязкоупругих и электрических характеристик эритроцитов у больных с жировой болезнью печени различного генеза с клинико-биохимическими показателями

Примечание. В круглых скобках указан показатель достоверности данного коэффициента корреляции, н – корреляция статистически незначима.

Для оценки значимости параметров эритроцитов с точки зрения дифференциальной диагностики алкогольной и неалкогольной жировой болезни печени был использован ROC-анализ с помощью построения приемных характеристических кривых (ROC-кривые) для различных характеристик клеток красной крови, результаты которого представлены на рис. 2. Получены высокие уровни AUC для наиболее значимых параметров эритроцитов (0,719-0,857), свидетельствующие о достаточно высоких уровнях показателей чувствительности и специфичности для отдельно взятых показателей клеток красной крови в качестве диагностических маркеров алкогольной и неалкогольной жировой болезни печени.

Рис. 2. ROC-кривые электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов для дифференциальной диагностики алкогольной и неалкогольной жировой болезни печени

Результаты оценки совокупности электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов пациентов со стеатозом различного генеза для выявления алкогольной и неалкогольной жировой болезни печени по сравнению с данными совокупных клинико-инструментальных методов исследования представлены в табл. 4.

Таблица 4

Результаты оценки совокупности электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов для выявления алкогольной и неалкогольной жировой болезни печени по сравнению с данными клинико-инструментальных методов исследования

Чувствительность 46 : (46 + 6) х 100 % = 88,5 %

Специфичность 26 : (2 + 26) х 100 % = 92,9 %

Прогностическая ценность «+»

результата метода 46 : (46 + 2) х 100 % = 95,8 %

Прогностическая ценность «-»

результата метода 26 : (6 +26) х 100 % = 81,3 %

Индекс точности (46 +26) / (46 +2 + 6 + 26) х 100 % = 90 %

Они демонстрируют достаточно высокие значения чувствительности (88,5 %) и специфичности (92,9 %), прогностической ценности положительного (95,8 %) и отрицательного результата (81,3 %), а также индекса точности (90 %). Возросшие уровни данных значений при исследовании совокупности параметров эритроцитов по сравнению с изолированным исследованием отдельных показателей клеток красной крови дают возможность предположить необходимость использования «панели электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов» исследования крови для дифференциальной диагностики алкогольной и неалкогольной жировой болезни печени. Особенно важны перспективы в определении истинно положительных результатов по алкогольной жировой болезни печени (по данным прогностической ценности «-» результата) в связи с необходимостью комплекса социальных, терапевтических, адаптационных мероприятий.

Заключение

Таким образом, метод диэлектрофореза эритроцитов в неоднородном переменном электрическом поле является перспективным в дифференциальной диагностике алкогольной и неалкогольной жировой болезни печени. Наиболее значимыми для целей диагностики оказались: средний диаметр эритроцита, амплитуда деформации при частоте 106Гц, степень деформации при 0,5х106Гц, обобщенные показатели вязкости и жесткости, поляризуемость при частоте 106Гц, величина дипольного момента. Комплексное использование параметров эритроцитов в отношении дифференцирования патологии печени различного генеза демонстрирует достаточно высокие значения чувствительности (88,5 %) и специфичности (92,9 %).