Однако особенности функционирования данного фермента при термической травме остаются недостаточно исследованными. В связи с этим целью данной работы явилось изученние кинетических свойств частично очищенного препарата АлДГ из печени крыс в условиях нормы и ожога с использованием в качестве субстратов различных альдегидов.
Материалы и методы
Исследования были проведены на белых крысах линии Vistar обоего пола массой 180-250 г. Животным опытной группы под эфирным наркозом наносили ватно-спиртовой ожог пламенем на тщательно освобожденных от шерсти 10%-ах поверхности кожи, экспозиция — 45 сек. Активность альдегиддеги-дрогеназы определяли по Б.М. Кершенгольц, Е.В. Серкиной [1], содержание белка — по методу Лоури в модификации [3]. Исследовали следующие кинетические характеристики фермента: Kt — время достижения 1/2 Vmax ферментативной реакции (мин); Vmax — мак-симальную скорость реакции (мкмоль/мин); Vmax/Kt (Ka) — коэффициент каталитической эффективности ферментативной реакции (мкмоль/мин2) [4].
Для получения ферментного препарата АлДГ из печени крысы использовали метод очистки, включающий несколько стадий: фракционирование белков сульфатом аммония в пределах насыщения 40-70%, гель-фильтрацию на сефадексе G-25, ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе [5]. Опыты проводили в 3-4-кратной биологической повторности, аналитические определения для каждой пробы - в двух повторностях. Результаты исследований обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента. Обработку данных осуществляли на персональном компьютере с помощью программы BIOSTAT.
Результаты и их обсуждение
В результате проведенных исследований получены ферменты АлДГ со степенью очистки 11, 0 (у интактных крыс) и 10,6 (у крыс с ожогом). Выход фермента составил в контрольной группе 45,3%, в опытной - 40,8%.
Удельная активность альдегиддегидрогеназы (в гомогенате) в контрольной группе была достоверно выше (на 21,9%), чем в опытной группе. Падение активности АлДГ у крыс с термической травмой, возможно, связано с уменьшением доли фермента в каталитически активном состоянии и с увеличением содержания высокотоксичных соединений, в частности молекул средней молекулярной массы. Последние, видимо, связываясь с ферментом, переводят его в новое конформационное состояние, которое характеризуется снижением сродства фермента к субстратам реакции и как следствие приводит к падению активности альдегиддегидрогеназы [2].
При использовании серии субстратов (алифатические с различной длиной углеродного скелета, ароматические) показано, что как у интактных крыс, так и обожженных животных с наибольшей скоростью происходило окисление циклического альдегида - салицилового, с несколько меньшей - альдегида с относительно большим алифатическим радикалом - глутарового. Значительно медленнее шло превращение бензальдегида (ароматического альдегида), формальдегида и ацетальдегида.
Показано, что при термической травме по сравнению с контролем активность АлДГ в частично очищенном препарате фермента снижается при использовании различных альдегидов в качестве субстрата. Так, с использованием глутарового альдегида активность АлДГ при ожоге снизилась на 36,0%, с ацетальдегидом - на 50,0%, салициловым альдегидом - на 28,0%, бензальдегидом - на 28,6%, формальдегидом - на 77,0%. Уменьшение активности по отношению ко всем субстратам, очевидно, связано с падением общей активности фермента при термической травме.
Основываясь на кинетических характеристиках, рассчитанных по J. Kostir [8], можно говорить о том, что время достижения 1/2 V ферментативной реакции уменьшилось при термической травме для следующих субстратов: для глутарового альдегида - на 8,2%, ацетальдегида - на 71,5%, салицилового альдегида - на 35,9%. На основании этих данных можно предположить, что степень сродства к ним повышается при ожоговой травме.
Для крыс с термической травмой по отношению к интактным характерно возрастание времени достижения 1/2 Vmax ферментативной реакции для бензальдегида, формальдегида в 6,0 и 12,5 раз соответственно, что свидетельствует о снижении сродства к этим альдегидам. Наивысшей каталитической эффективностью обладает альдегиддегидрогеназа с использованием в качестве субстрата глутарового альдегида. Так, у интактных крыс Vmax/Kt составила 45,38+0,03 мкмоль/мин2 , при ожоге - 39,88+3,02 мкмоль/мин2 .
При ожоге наибольшее сродство АлДГ имеет к глутаровому альдегиду. Время полупревращения глутарового альдегида для альдегиддегидрогеназной реакции составило 0,56+0,03 мин. У животных опытной группы по сравнению с контрольной снижался коэффициент каталитической эффективности для превалирующего большинства субстратов: для глутарового альдегида - на 12,1%, ацетальдегида - на 31,9%, салицилового альдегида - на 83,5%, формальдегида - на 97,5%.
Таким образом, альдегиддегидрогеназа участвует в метаболизме глутарового альдегида, ацетальдегида, салицилового альдегида, бензальдегида, формальдегида. Как у интактных крыс, так и обожженных животных с наибольшей скоростью АлДГ окисляет салициловый и глутаровый альдегиды. Наивысшей каталитической эффективностью характеризуется альдегиддегидрогеназа с использованием в качестве субстрата глутарового альдегида в контрольной и опытной группах животных.
Список литературы
- Кершенгольц Б.М., Серкина Е.В. Некоторые методические подходы к изучению метаболизма этанола // Лабораторное дело. - 1981. - № 2. - С. 126.
- Кирпичева А.Г., Зимин Ю.В. Влияние молекул средней массы на альдегиддегидрогеназную систему печени и эритроцитов в эксперименте // Успехи современного естествознания. - 2004. - №4. - С. 21-24.
- Dawson J.M., Heatlic P.L. Lowry method of protein quantification Evidence for Photosensitivity // Anal. Biochem. - 1984. - Vol. 140, №2. - P. 391-393.
- Kostir J. Prime stanoveni michaelisovy konstanty // Chemicke Listy. - 1985. - Vol. 79, №9. - P. 989-991.
- Lindahl R., Evces S. Rat liver aldehyde dehydrogenase // The jour. of biolog. chemistry. - 1984. - Vol.295, № 19. - P. 11896-11990.
- Townsend A.J., Leone-Kabler S., Haynes R.L., Wu Y., Szweda L., Bunting K.D. Selective protection by stably transfected human ALDH3A1 (but not human ALDH1A1) against toxicity of aliphatic aldehydes in V79 cells // Chem Biol Interact. - 2001. Vol. 130-132, № 1-3. - P. 261-273.
Библиографическая ссылка
Соловьева А.Г. КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ АЛЬДЕГИДДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПЕЧЕНИ КРЫС ПРИ ОЖОГЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТА РАЗЛИЧНЫХ АЛЬДЕГИДОВ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2010. – № 11. – С. 36-37;URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=1107 (дата обращения: 07.11.2024).