Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РЕТИНОПАТИИ НЕДОНОШЕННЫХ

Катаргина Л.А. 2 Хорошилова-Маслова И.П. 2 Майбогин А.М. 2 Панова И.Г. 1 Осипова Н.А. 2
1 ФГБУH «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН
2 ФГБУ «МНИИ ГБ им.Гельмгольца» Минздрава РФ
Исследованы патоморфологические признаки экспериментальной ретинопатии недоношенных (РН) на крысиной модели заболевания. Новорожденных крысят Вистар на 14 суток помещали в инкубатор, где каждые 12 часов концентрация кислорода колебалась между 60 и 15 % (модель «60/15»). На 10, 14, 18 и 28 сутки проводили энуклеацию с последующими гистологическим и иммуногистохимическим исследованиями, выявившими динамику нарушений процесса васкуляризации сетчатки и изменений ее структуры. На 10 сутки отмечалась недоразвитость слоев сетчатки и задержка васкуляризации ее периферических отделов. Начиная с 14 суток наблюдались нормализация ее структурных элементов и усиление вазопролиферативных процессов, преимущественно на периферии (в постэкваториальной зоне). На 18 и 28 сутки отмечалось прогрессирование вазопролиферации с прорастанием сосудов через внутреннюю пограничную мембрану сетчатки в полость стекловидного тела. Выявленные нарушения процесса васкуляризации сетчатки аналогичны наблюдаемым при РН в клинике.
крысиная модель ретинопатии недоношенных
эндотелиальные клетки
гиперхромные ядра
PCNA
патологическая вазопролиферация сетчатки
1. Катаргина, Л.А. Ретинопатия недоношенных / Л.А. Катаргина, Л.В. Коголева // Избранные лекции по детской офтальмологии. – М., 2009. – С. 27–61.
2. Катаргина Л.А. Экспериментальное исследование роли окислительного стресса в патогенезе ретинопатии недоношенных как перспективное направление поиска новых медикаментозных подходов к ее профилактике и лечению // Российский офтальмологический журнал. – 2016. – Т. 9, № 1. – С. 68 – 73.
3. Dorfman A. Early Manifestations of Postnatal Hyperoxia on the Retinal Structure and Function of the Neonatal Rat. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2008.- Vol.1, № 49. – P. 458–66.
4. Dorfman A. Immunohistochemical Evidence of Synaptic Retraction, Cytoarchitectural Remodeling, and Cell Death in the Inner Retina of the Rat Model of Oygen-Induced Retinopathy (OIR) // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2011. – Vol. 3, № 52. – P. 1693–1708.
5. Fletcher E.L. The significance of neuronal and glial cell changes in the rat retina during oxygen-induced retinopathy. Doc. Ophthalmol. – 2010. № 120. – Р. 67–86.
6. Gilbert C. Retinopathy of prematurity as of blindness worldwide and babies at risk / C. Gilbert // III World Retinopathy of prematurity Congress: abstract Book. – Shanghai, 2012. – P. 36.
7. Grossniklaus H.E., Kang S.J., Berglin L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization // Prog. Retin. Eye Res. 2010. Vol. 6. № 29. P. 500–19.
8. Hartnett M.E. Studies on the Pathogenesis of Avascular Retina and Neovasculatization into the Vitreous in Peripheral Severe Retinopathy of Prematurity (An American Ophthalmological Society Thesis) // Trans. Am. Ophthalmol. Soc. – 2010. – № 108. – Р. 96–119.
9. Xiao-Ling Liu. Genetic Inactivation of the Adenosine A2A Receptor Attenuates Pathologic but Not Developmental Angiogenesis in the Mouse Retina // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2010. – Vol. 12. № 51. – Р. 6625–32.

Ретинопатия недоношенных (РН) – тяжелое вазопролиферативное заболевание, которое является одной из ведущих причин детской инвалидности по зрению [1,6]. Патогенез заболевания до конца не изучен и является предметом многочисленных исследований, немалая доля которых базируется на эксперименте [7,8].

В настоящее время наиболее популярными являются модели РН на крысах, что во многом основано на данных о высоком сходстве строения сосудистой системы глаз человека и крыс, а также сходстве процесса ретинальной васкуляризации [4,7,8]. Известно, что, при адекватном моделировании триггерную роль в развитии РН у животных играют колебания концентрации подаваемого в ходе эксперимента кислорода, которые, как было показано, приводят к дисбалансу про- и антиангиогенных факторов роста сосудов при развитии РН у детей [3].

Веки новорожденных крысят сращены до 14–15 суток. Данная особенность постнатального развития придаточного аппарата органа зрения делает невозможным проведение биомикроскопического и офтальмоскопического обследования глаз крысят в данный период времени, который, как известно, является критическим для развития РН, поэтому основную роль в оценке развития и течения заболевания играют морфологические и биохимические методы исследования.

Целью работы явилось изучение патоморфологических изменений при экспериментальной РН на разных сроках ее развития.

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено на 64 новорожденных крысятах породы Вистар, которые были разделены на 2 равные по числу крысят группы: опытную, с экспериментальной РН, и контрольную. С целью воспроизведения экспериментальной РН новорожденных крысят на 14 суток помещали в инкубатор вместе с самкой. Каждые 12 часов концентрация кислорода в инкубаторе колебалась от 60 до 15 % (модель «60/15»). Выбранная схема подачи кислорода основывается на знании о том, что использование переменных концентраций кислорода является значительно более эффективным стимулом развития пролиферативной ретинопатии у новорожденных крысят в сравнении с воздействием постоянной гипероксии, и ряд исследователей полагают, что эпизоды гипоксии могут играть ключевую роль в патогенезе РН [7, 8]. Затем крысят помещали в условия с нормальным содержанием кислорода (21 %). На протяжении эксперимента в помещении поддерживали постоянный температурный (26°С) и световой (12 часов день, 12 часов ночь) режимы. Контрольную группу составили крысята, находившиеся с момента рождения в условиях с нормальным содержанием кислорода.

Крысят выводили из эксперимента на 10-е, 14-е, 18-е и 28-е сутки. Выбор сроков энуклеации основывался на сведениях о нормальном ангиогенезе сетчатки крысят, а также на результатах полученных ранее биохимических исследований [2]. Глаза (по 12 глаз из каждой группы на каждый срок) фиксировали в растворе Буэна 24 часа. На фиксированных глазах производили срединный разрез в области лимба и удаляли роговицу и хрусталик. После этого глаза подвергали стандартной гистологической проводке с последующей заливкой в парафин. Готовили серийные меридиональные срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Готовые препараты исследовали с помощью микроскопической системы фирмы Leica со встроенной цифровой камерой.

Энуклеированные на 14-е и 28-е сутки глаза (по 8 глаз из каждой группы) использовали для приготовления полутонких срезов и иммуногистохимического анализа. Для приготовления полутонких срезов глазные яблоки фиксировали в 10 % нейтральном формалине 2-е суток. После промывания и вскрытия глаз, выделенные фрагменты сетчатки дофиксировали в 4 % глутаральдегиде 1 сутки и в OsO4 1 час. Затем проводились обезвоживание в спиртах восходящей крепости и заливка в эпоксидную смолу. Срезы готовили на ультрамикротоме фирмы Leica (толщина срезов 1 микрон), помещали на предметные стекла и окрашивали метиленовым синим. Исследование осуществляли с помощью микроскопической системы фирмы Leica со встроенной цифровой камерой при увеличении х100 – х400. Для иммуногистохимического исследования использовали антитела к ядерному антигену пролиферирующих клеток PCNA (DAKO). Для этого в эпоксидных срезах проводилось удаление эпоксидной смолы (метод Compachiaro) с последующим иммунным окрашиванием путем использования стрептавидин-биотинового пероксидазного метода с использованием коммерческих наборов реагентов (DAKO).

Результаты исследования и их обсуждение

На 10-е сутки слои сетчатки глаз контрольной группы крысят характеризовались четкой дифференцировкой и были представлены: наружным и внутренним ядерным слоями (НЯС и ВЯС), наружным и внутренним плексиформным слоем (НПС и ВПС), слоем ганглиозных клеток (СГК). На крайней периферии НЯС и ВЯС сетчатки были разделены узким НПС, отмечалось наличие микрососудов в слое нервных волокон (СНВ), что является морфологическим маркером васкуляризации сетчатки (рис. 1 А). В глазах крысят из опытной группы на данном сроке наблюдалось нарушение стратификации слоев сетчатки на периферии: полностью отсутствовал НПС, а внутренний и наружный ядерные слои были представлены единым конгломератом без четкой дифференцировки. При этом, на крайней периферии сетчатки определялась аваскулярная зона (рис.1 Б), что позволяет сделать предположение о взаимосвязи обнаруженных структурных изменений сетчатки с нарушением васкуляризации ее периферических отделов.

kat1.tif

Рис. 1. Сетчатка новорожденных крыс на 10-е сутки рождения: А – В контроле: 1 – НЯС; 2 – НПС; 3 – ВЯС; 4 – ВПС; 5 – СГК; 6 – СНВ (стрелками указаны сосуды сетчатки); Б – В условиях кислородной инкубации в течение 10 суток: 1 – конгломерат ядер; 2 – ВПС; 3 – СГК; 4 – СНВ. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х200

На 14-е сутки в контрольных глазах структура сетчатки и состояние ее сосудистой системы не имели значительных морфологических отличий по сравнению с аналогичным материалом на 10-е сутки (рис. 2 А). В опытных глазах на 14-е сутки, а именно, к моменту окончания воздействия на крысят переменных концентраций кислорода, отмечалось восстановление структуры сетчатки на периферии, которое сопровождалось врастанием сосудов и восстановлением кровообращения в этой зоне (рис. 2 Б). На полутонких срезах сетчатки крыс из опытной группы на данном сроке выявлялась гиперхромия ядер эндотелиальных клеток, наиболее выраженная в сосудах центральной зоны (рис. 2 В). Данные изменения указывали на повышенную функциональную активность эндотелия, не наблюдаемую в сосудах сетчатки крысят из контрольной группы (ядра эндотелиальных клеток крысят контрольной группы были гипохромны). Подтверждением этому служит обнаруженная нами экспрессия антигена PCNA в клетках эндотелия (рис. 2 Г), которая свидетельствовала об активизации их репликативного потенциала.

На 18-е и 28-е сутки в сетчатке крысят опытной группы отмечалось развитие патологической вазопролиферации. Определялось врастание сосудов до внутренней пограничной мембраны (ВПМ), в которой определялись деструктивные изменения. На 28-е сутки отмечался экстраретинальный рост сосудов в полость стекловидного тела через разрушенную ВПМ, что объективно указывало на прогрессирование патологического процесса (рис. 3. А, Б, В). При этом в эндотелии новообразованных сосудов определялась экспрессия антигенов к PCNA (рис. 3 Г). Полученные данные позволяют предполагать, что формируемые de novo сосуды могут принимают участие в формировании эпиретинальной мембраны, характерной для пролиферативной витреоретинопатии любой этиологии, и для РН в частности.

kat2.tif

Рис. 2. Сетчатка новорожденных крыс на 14-е сутки после рождения: А – В контроле: 1 – НЯС; 2 – НПС; 3 – ВЯС; 4 – ВПС; 5 – СГК; 6 – СНВ; 7 – ВПМ (стрелками указаны сосуды сетчатки); Б – В условиях кислородной инкубации в течение 14 суток. Наблюдается появление сосудов на периферии сетчатки: 1 – НЯС; 2 – НПС; 3 – ВЯС; 4 – ВПС; 5 – СГК; 6 – СНВ; 7 – ВПМ (стрелками указаны сосуды сетчатки). Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х200. В) Гиперхромные ядра в эндотелии сосудов сетчатки у опытных животных. Полутонкие срезы. Окраска метиленовым синим. Увеличение х400; Г – Положительная экспрессия PCNA в ядрах эндотелиальных клеток ретинального сосуда у опытных крысят. Полутонкие срезы. Увеличение х400

kat3.tif

Рис. 3. Сетчатка новорожденных крысят на 18 и 28-е сутки после рождения: А – Сосуд сетчатки крысенка опытной группы на 18-е сутки, стенка которого располагается вплотную к ВПМ; Б – Сосуд сетчатки крысенка опытной группы на 28-е сутки. Разрушение ВПМ в зоне прорастания сосуда в стекловидное тело. Окраска гематоксилином и эозином. х400; В – Зона экстраретинального прорастания сосудов сетчатки в стекловидное тело у крысенка опытной группы на 28-е сутки. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим. х400; Г – Сохранение положительной экспрессии PCNA в ядрах эндотелиальных клеток ретинальных сосудов крысенка опытной группы на 28-е сутки. Полутонкий срез. х400

Полученные на нашей крысиной модели РН «60/15» результаты согласуются с данными литературы. Так, группой ученых на мышиной модели заболевания было показано, что при развитии ретинопатии на сроке, соответствующем пику неоваскуляризации, в препаратах сетчатки мышат определяются пролиферирующие ядра клеток, локализующихся с витреальной стороны от ВПМ сетчатки, в которых при иммуногистохимическом исследовании выявлялась повышенная экспрессия PCNA [9]. В ряде других исследований на крысиной модели РН «50/10» в препаратах сетчатки на 18-е сутки, которые также представляют собой пик неоваскуляризации в данной модели, определялись новообразованные сосуды на поверхности сетчатки в периферических отделах [5]. В нашей работе наряду с процессом патологической вазопролиферации сетчатки глаз крысят с экспериментальной РН, выявлены изменения структурной организации ядер эндотелиальных клеток ретинальных сосудов (появление гиперхромных ядер), коррелирующие с выраженной экспрессией PCNA. Это свидетельствует об изменении метаболизма эндотелиальных клеток в сторону активации их пролиферативного потенциала, что, в конечном итоге, определяет их избыточный патологический рост и прорастание через ВПМ сетчатки.

Заключение

Результаты проведенных патоморфологических и иммуногистохимических методов исследования доказывают стадийность изменений со стороны ретинальных сосудов в условиях экспериментальной РН. Наблюдающиеся в воспроизведенной нами оригинальной крысиной модели заболевания изменения аналогичны последовательным 1–3 стадиям активной фазы РН в клинике. Это свидетельствует об адекватности представленной экспериментальной модели и возможности ее использования для изучения различных аспектов патогенеза заболевания и поиска новых методов воздействия на ее развитие и течение.


Библиографическая ссылка

Катаргина Л.А., Хорошилова-Маслова И.П., Майбогин А.М., Панова И.Г., Осипова Н.А. ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РЕТИНОПАТИИ НЕДОНОШЕННЫХ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2017. – № 3-2. – С. 190-194;
URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=11424 (дата обращения: 06.05.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074