Научный журнал

Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Шкурупий В.А. 1, 2 Ильин Д.А. 1 Архипов С.А. 2

---

1 ФГБНУ НИИ экспериментальной и клинической медицины

2 ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» МЗ РФ

In vitro в перитонеальных макрофагах (МФ) интактных мышей-самцов линии BALB/c (контроль) и инфицированных животных через 90 суток после внутрибрюшинного введения им M. tuberculosis (МБТ) из вакцины БЦЖ обнаруживали увеличение количества полиядерных МФ. В контроле было незначительное количество МФ, экспрессировавших IL-1α. У инфицированных мышей вне зависимости от количества в них ядер – несколько больше. У интактных мышей IFN-γ экспрессировали от 11 % до 64 % МФ в соответствии с количеством ядер в них, а у инфицированных – их было значительно больше вне зависимости от численности ядер. В контроле bFGF и TGF-1β экспрессировали МФ с различным количеством ядер. У инфицированных животных количество экспрессировавших их МФ с различным числом ядер достигало 90 % и более. Полиядерность (и ее следствие – полиплоидия), увеличение числа МФ, экспрессировавших указанные факторы, видимо, являлись неспецифической реакцией МФ на незавершенность фагоцитоза корпускулярного объекта – МБТ.

Статья в формате PDF

1768 KB

многоядерные макрофаги

in vitro

микобактерии туберкулеза

персистенция

1. Шкурупий В.А. Туберкулезный гранулематоз. Цитофизиология и адресная терапия / В.А. Шкурупий. – М.: Изд-во РАМН, 2007. – 536 с.

2. Исследование фибротических осложнений и концентрации гидроксипролина в печени мышей в различные периоды развития генерализованного БЦЖ-гранулематоза / В.А. Шкурупий [и др.] // Бюл. экспер. биол. мед. – 2014. – Т. 157, № 4. – С. 463–467.

3. Zhang L., Yan J.W., Wang Y.J., Wan Y.N., Wang B.X., Tao J.H., Chen B., Li B.Z., Yang G.J., Wang J. Association of interleukin 1 family with systemic sclerosis // Inflammation. – 2014. – Vol. 37. № 4. – P. 1213–1220.

4. Yum H.Y., Cho J.Y., Miller M., Broide D.H. Allergen-induced coexpression of bFGF and TGF- 1 by macrophages in a mouse model of airway remodeling: bFGF induces macrophage TGF- 1 expression in vitro // Int. Arch. Allergy Immunol. – 2011. – Vol. 155. № 1. – P. 12–22.

5. Piao S., Choi M.J., Tumurbaatar M., Kim W.J., Jin H.R., Shin S.H., Tuvshintur B., Yin G.N., Song J.S., Kwon M.H., Lee S.J., Han J.Y., Kim S.J., Ryu J.K., Suh J.K. Transforming growth factor (TGF)- type I receptor kinase (ALK5) inhibitor alleviates profibrotic TGF- 1 responses in fibroblasts derived from Peyronie’s plaque // J. Sex. Med. – 2010. – Vol. 7. № 10. – P. 3385–3395.

6. Strutz F., Zeisberg M., Renziehausen A., Raschke B., Becker V., van Kooten C., Muller G. TGF-beta 1 induces proliferation in human renal fibroblasts via induction of basic fibroblast growth factor (FGF-2) // Kidney Int. – 2001. – Vol. 59. № 2. – P. 579–592.

7. Chen Z., Tan W., Zhang L., Tan Q., Yang J. Beneficial Impact of bFGF Antisense Therapy in a Rat Model of Pulmonary Fibrosis // Sarcoidosis Vasc. Diffuse Lung Dis. – 2015. – Vol. 32. № 1. – P. 22–31.

8. Poosti F., Bansal R., Yazdani S., Prakash J., Post E., Klok P., van den Born J., de Borst M.H., van Goor H., Poelstra K., Hillebrands J.L. Selective delivery of IFN- to renal interstitial myofibroblasts: a novel strategy for the treatment of renal fibrosis // FASEB J. – 2015. – Vol. 29. № 3. – P. 1029–1042.

9. Ong C.W., Elkington P.T., Friedland J.S. Tuberculosis, pulmonary cavitation, and matrix metalloproteinases // Am. J. Respir. Crit. Care Med. – 2014. – Vol. 190. № 1. – P. 9–18.

10. Фагоцитоз макрофагами молекулярно-наносомальных гибридных композиций с окисленными декстранами, конъюгированными с гидразидом изоникотиновой кислоты / В.А. Шкурупий [и др.] // Бюл. экспер. биол. мед. – 2009. – Т. 147, № 12. – С. 633–636.

Система мононуклеарных фагоцитов интегрирует в организме ее клиринговую функцию (в широком смысле) и сопряженные с ней ряд процессов: органоспецифические метаболические, иммунные, воспаления и репаративной регенерации, опосредуя его взаимодействие с факторами внешней и внутренней среды. Фагоцитирующие клетки, прежде всего МФ, в отличие от других клеток, способны рецептировать, захватывать, трансформировать и регургитировать широкий спектр ксено- и эндобиотических корпускулярных объектов. Это предполагает наличие у них иных отличающихся от других клеток организма способов реагирования на эти факторы.

Наиболее интересной представляется проблема так называемых гранулематозов, объединяющих около 70 заболеваний, развивающихся не по классическому «сценарию» воспаления. Для них характерна гиперплазия фагоцитирующих клеток и образование из них в интерстиции тканей так называемых гранулем. Они формируются преимущественно моноцитами, МФ и их многоядерными производными: многоядерными клетками инородных тел после захвата МФ биосовместимого корпускулярного материала неживой природы, многоядерными так называемыми эпителиоидными – и клетками Лангханса, при захвате МФ бактерий, грибов и корпускулярных факторов неживой природы [1].

В гранулемах МФ сосредоточен огромный лизосомальный продеструктивный потенциал [1]. Классическим гранулематозом является туберкулез, индуцируемый M. tuberculosis (МБТ). Попав в организм, они размножаются, свободно циркулируя в крови и лимфе. Но какая-то часть МБТ, будучи захваченной фагоцитирующими клетками, прежде всего моноцитами и МФ, начинают персистировать изначально в резидентных органоспецифических МФ. Эти МФ, генерирующие хемоаттрактанты, вначале являются центрами формирования так называемых типичных воспалительных инфильтратов. Уже в пределах двух недель после инфицирования в этих локусах начинают формироваться типичные гранулемы, вначале из макрофагов, моноцитов, а затем из клеток, упомянутых выше [2]. Важнейшим фактором формирования гранулем и этих клеток, видимо, является продолжительность персистенции эндоцитированных объектов, детерминированная либо абсолютной невозможностью их биодеградации и регургитации, либо значительной их отсроченностью по ряду причин [1]. В случае продолжения персистенции эндоцитированного фактора через какой-то период времени в МФ, видимо, активируются процессы экспрессии структурных и ферментных белков.

Общеизвестно, что в патогенезе хронического туберкулезного гранулематозного воспаления наиболее тяжелыми осложнениями являются деструктивные процессы в паренхиматозных органах, их фиброз и цирроз – процессы не поддающиеся терапии и нередко приводящие пациентов к инвалидности [1]. В этой связи исследование патогенетических факторов, детерминирующих эти процессы, актуально. В частности, представляется важным исследование роли МФ в регуляции этих процессов, принимая во внимание, что МФ, осуществляя клиринговую функцию в отношении микобактерий туберкулеза, способны модулировать реакцию организма на бактериальную и иные инвазии. В значительной степени в определении характера реакции МФ большая роль принадлежит ксенобиотическому фактору, нередко детерминирующему не только возможность процесса его эндоцитоза, но и длительной персистенции в вакуолярном аппарате МФ на экспрессию указанных цитокинов. В полной мере это относится к МБТ [1]. Одной из наименее изученных и, видимо, неспецифических реакций МФ на длительную персистенцию в них корпускулярного объекта является образование многоядерных форм МФ.

Однако роль многоядерных МФ, принимающих участие в патогенезе гранулематозных заболеваний, включая туберкулезный гранулематоз, и имеющих высокую степень функциональной активности в плане продукции комплекса различных факторов [1], включая ряд про- и противофиброзных цитокинов, участвующих в реализации вышеуказанных реакций остается малоизученной. Это обстоятельство, учитывая высокую способность МФ к синтезу медиаторов, регулирующих реакции формирования гранулем и индукции процессов фиброзирования органов при туберкулезном гранулематозе, определяет актуальность настоящего исследования [1].

В регуляцию процесса воспаления и его завершающей стадии – фиброза вовлекаются МФ их про- и противофиброзные цитокины. Известно, в частности, что интерлейкин-1 (IL-1) обладает провоспалительной и профиброзной активностью, играя потенциальную роль в процессе фиброза [3]. Значительный профиброзный эффект, присущий указанному медиатору, определяет необходимость исследования вероятности его экспрессии многоядерными МФ.

Кроме того, МФ могут экспрессировать основной фактор роста фибробластов (bFGF) и трансформирующий фактор роста фибробластов-β1 (TGF-β1) [4]. Показано, что bFGF индуцирует экспрессию TGF-β1 у МФ [4]. При этом TGF-β1 присущи профиброзные эффекты [5], вероятно, обусловленные способностью данного цитокина вызывать пролиферацию фибробластов [6]. Поэтому следует указать, что и bFGF обладает митогенной активностью по отношению к фибробластам [4]. Показано, что bFGF опосредует развитие фиброза, являясь промоутером синтеза коллагена, содействует пролиферации и дифференцировки фибробластов [7].

Выраженным противофиброзным эффектом обладает интерферон-γ (IFN-γ) [8]. Этот цитокин детерминирует ингибирование активности процессов, определяющих развитие фиброза [8], что обусловливает актуальность изучения его продукции многоядерными МФ, обладающих высоким синтетическим потенциалом в отношении различных факторов, контролирующих ряд клеточных реакций, составляющих основу патогенеза хронических воспалительных заболеваний, характеризующихся образованием фиброзных изменений в тканях. Как известно, провоспалительные цитокины определяют активность матриксных металлопротеиназ [9]. Поскольку провоспалительные цитокины IL-1 и IFN-γ имеют противоположный эффект в отношении реализации процесса фиброзирования [3; 8], то не исключено, что данные цитокины опосредованно модифицируют противофибротический эффект матриксных металлопротеиназ, таким образом принимая участие в процессе регуляции формирования фиброзирования тканей.

Цель работы – исследование in vitro реакции МФ на захват ими длительно внутриклеточно персистирующего фактора биологической природы – M. tuberculosis.

Материалы и методы исследования

В работе in vitro использовали МФ перитонеального транссудата (ПТ) мышей-самцов линии BALB/c. Были использованы контрольная культура МФ ПТ от интактных животных и подопытные культуры клеток, выделенных от животных, внутрибрюшинно инфицированных микобактериями вакцины БЦЖ (МБТ) через 90 суток после введения им МБТ [1] в 0,25 мл изотонического водного раствора NaCl в дозе 0,5 мг. Культуры МФ инкубировали на покровных стеклах в течение 48 часов в культуральных планшетах при 37 °С, затем фиксировали 4 % водным раствором формальдегида, приготовленным на фосфатном буфере.

При увеличении в 400 раз с помощью светового микроскопа в культурах клеток ПТ исследовали частоту встречаемости одноядерных, двуядерных и содержащих 3 и более ядер МФ. Исследовали экспрессию МФ с вышеуказанными классами ядерности IL-1α, bFGF, TGF-β1 и IFN-γ непрямым иммуноцитохимическим методом с использованием системы визуализации на основе биотин-стрептавидин-пероксидазного комплекса «BD Pharmingen» Anti-Rat Ig HRP Detection Kit и диагностических наборов моноклональных антител «Novocastra». Наличие экспрессии у МФ IL-1α, bFGF, TGF-β1, IFN-γ регистрировали по «специфической» окраске цитоплазмы светло-коричневого цвета.

Статистическую обработку результатов анализа проводили с помощью компьютерной программы «Statistica 8». Оценку вероятности достоверности различий между сравниваемыми средними величинами проводили с учетом непараметрического критерия Манна – Уитни. Полученные данные были представлены в таблице в виде M ± m. Различия между сравниваемыми средними величинами считали достоверными при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В клеточных культурах контрольной группы МФ количество двух и более ядерных клеток было соответственно в 1,5 и 2,6 раза меньшим, чем в перитонеальном транссудате от мышей через 90 сут. после их инфицирования МБТ из вакцины БЦЖ. МФ, экспрессировавшие провоспалительный интерлейкин – IL-1α, были немногочисленными как среди многоядерных МФ из культур контрольной группы, так и среди МФ, выделенных от инфицированных МБТ животных (таблица).

В подопытных культурах наблюдали некоторые отличия по этому параметру между МФ с разным количеством ядер. При исследовании количества МФ, экспрессировавших IFN-γ, выяснилось, что его экспрессировали в группе контроля МФ с различным количеством ядер, чаще всего те, в которых ядер было больше (таблица).

В подопытной группе культур МФ, вне зависимости от количества ядер в них, около или несколько больше 80 % из их числа экспрессировали этот фактор иммунной антибактериальной защиты (таблица). Таким образом, инфицированные МФ демонстрировали довольно сильную реакцию на инвазию МБТ, а интактные МФ – своего рода «готовность» к вероятной инвазии бактериальными факторами.

Однако МФ, видимо, не «воспринимали» МБТ как микрофлору, способную индуцировать «классическое» воспаление, судя по количеству МФ, экспрессировавших интерлейкин IL-1α (таблица). Это вполне объяснимо, поскольку IL-1 является провоспалительным цитокином [9], но гранулематозы до развития в гранулемах спонтанных некрозов не являются классическим воспалением, а при БЦЖ-гранулематозе их не бывает [1].

При туберкулезе МБТ, персистирующие в вакуолярном аппарате МФ, индуцируют их трансформацию в упомянутые многоядерные клетки. Эта популяция МБТ, персистирующая в многоядерных МФ, несет угрозу реинфицирования, а с многоядерными МФ в гранулемах сопряжены как риски деструктивных процессов в связи с их гигантским гидролитическим потенциалом, так и фиброзирования органов [1].

Результаты исследования долей разнящихся по классам ядерности МФ ( %), экспрессировавших IL-1α, bFGF, TGF-β1 и IFN-γ, в культурах МФ мышей линии BALB/c (M ± m)

Примечание. n – количество образцов культур МФ при определении количества МФ, экспрессировавших каждый из исследованных факторов (n = 6); *p < 0,05 по сравнению с контролем.

Процесс фиброзирования при туберкулезе начинает формироваться задолго до развития деструктивных процессов в гранулемах и в органах [1; 2]. Видимо, это происходит в связи с секрецией активированными МБТ МФ гранулем профиброгенных факторов. Согласно представленным данным из таблицы количество МФ из групп контроля, экспрессировавших bFGF, увеличивалось по мере увеличения в них количества ядер, а у инфицированных МБТ мышей количество этих МФ увеличивалось более значительно. Аналогичный феномен мы наблюдали и в МФ групп контроля и МФ, инфицированных МБТ, в отношении экспрессии ими TGFβ-1 (таблица). Однако привлекает внимание большее количество МФ, особенно в группе контроля и в подопытной группе, экспрессировавших упомянутые профиброгенные факторы, по сравнению с количеством МФ, экспрессировавших IL-1α.

Известно, что МБТ в процессе коэволюции со своими хозяевами – объектами паразитирования, приобрели способность препятствовать процессу слияния первичной эндосомы (в которой они находятся) с лизосомами МФ [1; 10]. Это приводит к образованию так называемых L-форм паразита и длительному их персистированию в вакуолярном аппарате МФ [1]. Этот феномен является наиболее сложной проблемой лечения туберкулеза и его осложнений.

Следует заметить, что макроорганизму, по сути, приходится формировать стратегии борьбы с двумя формами МБТ – в свободно циркулирующей доступной нейтрофильным лейкоцитам и иммунной системе и другой, «укрывающейся» в макрофагах и представляющей собою угрозу реинфицирования, образования гранулем и осложнений, связанных с ними. Полученные данные свидетельствуют о том, что туберкулезный гранулематоз не является классическим воспалением и, видимо, правильнее использовать термин – гранулематоз, указывая на этиологический фактор.

Все МФ с учетом того, что они имеют большое количество различных рецепторов, а среди них так называемый scavenger-рецептор, и поэтому они, видимо, постоянно находятся в той или иной степени в активированном состоянии, реализуя клиринговую функцию. Об этом свидетельствуют и данные о МФ в группе контроля, представленные в таблице. Вместе с тем захват ими биосовместимых объектов, но не биодеградабельных или деградируемых достаточно продолжительное время, видимо, сопряжен с неспецифической активацией синтеза ДНК, экспрессией и синтезом лизосомальных гидролаз как следствие реализованной клиринговой функции (возможно, потенциально трофической – в отношении некоторых объектов).

Так, при лечении мышей, инфицированных МБТ гибридными молекулами гидразида изоникотиновой кислоты с декстраном (медленно биодеградируемый полисахарид, время полувыведения из организма 3,5 сут.) [1], мы наблюдали в эпителиоидных клетках (полиплоидных макрофагальных производных) туберкулезных гранулем существенное увеличение количества: прикрепленных и свободных полисомальных рибосом, суммарной концентрации мембран цитоплазматических органоидов и лизосом, относительно величин тех же параметров в многоядерных эпителиоидных клетках мышей, не получавших декстран [1]. Таким образом, полиядерность МФ и увеличение экспрессии ими ряда белков могут быть сопряжены с неспецифической активацией пластических процессов в них в связи с длительным пребыванием в вакуолярном аппарате биосовместимых ксенобиотических медленно или небиодеградируемых факторов – МБТ.

Не исключено также, что такого рода неспецифическое увеличение синтетической активности многоядерных клеток может быть сопряжено и с активацией экспрессии ими профибротических цитокинов и резкой активацией фибротических процессов как в гранулемах, так и во внутренних органах. Это наблюдали ранее при формировании так называемого ядра из эпителиоидных клеток в туберкулезных БЦЖ-гранулемах [1].

Заключение

Изложенные в этой работе и имеющиеся в научной литературе результаты не объясняют, почему по своей сути трофический акт – захват, интернализация и персистирование в вакуолярном аппарате МФ корпускулярного фактора, в данном случае МБТ, сопряжен с феноменом полиядерности и неспецифической активацией пластических процессов. Очевидно, что для прояснения этого вопроса, а также для поиска средств и способов ограничения развития процессов фиброзирования – тяжелого осложнения многих (не только гранулематозных) заболеваний необходимы дальнейшие исследования.

Особый интерес представляет феномен незавершенности эндоцитоза и персистенции в вакуолярном аппарате МФ, эндоцитированных факторов различной природы не только в связи с процессами фиброзирования, а как некий, возможно, неспецифический ответ системы мононуклеарных фагоцитов, который возможно реализуется при взаимодействиях организма с целым рядом факторов внешней среды различной природы.

Библиографическая ссылка