Научный журнал

Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Бедина С.А. 1 Мозговая Е.Э. 1 Трофименко А.С. 1, 2 Зборовская И.А. 1, 2

---

1 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной ревматологии им. А.Б. Зборовского»

2 ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Описан профиль активности ксантиноксидазы (КО) и ксантиндегидрогеназы (КДГ) в плазме крови и циркулирующих лимфоцитах у 75 (52 женщины и 23 мужчины) больных ревматоидным артритом (РА). Диагноз устанавливался на основе критериев, рекомендованных ACR/EULAR 2010. Степень активности ревматоидного процесса определялась с использованием индекса DAS 28. Серопозитивная форма РА наблюдалась у 49 (65,3 %) больных. В качестве контроля использовали образцы 35 здоровых лиц. Для энзимного профиля больных РА характерно повышение активности КО в плазме крови и снижение активности КО и КДГ в лимфоцитах. Проведенные нами исследования выявили зависимость изученных энзимных показателей от наличия или отсутствия ревматоидного фактора. Показано, что у больных с серопозитивной формой РА активность КО в плазме крови повышена в большей степени, чем при серонегативном варианте, а активность КДГ, сниженная при серонегативной форме РА, повышается у больных с серопозитивным РА. В лизатах лимфоцитов активность КО и КДГ снижена при обеих формах РА. Наиболее выраженные изменения активности энзимов обнаружены у больных РА с серопозитивной формой.

Статья в формате PDF

325 KB

ревматоидный артрит

ксантиноксидаза

ксантиндегидрогеназа

лизаты лимфоцитов

плазма крови

1. Воробьева Н.В. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: механизмы образования, роль в норме и при патологии / Н.В. Воробьева, Б.В. Пинегин // Биохимия. – 2014. – Т. 79, Вып. 12. – С. 1580–1591.

2. Wright H.L. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis / H.L. Wright, R.J. Moots, S.W. Edwards // Nature Reviews Rheumatology. – 2014. – Vol. 10(10). – P. 593–601. URL: http://www. nature.com/nrrheum/journal/vaop/ncurrent/full/nrrheum.2014.80.html (date of access: 17.05.2018).

3. NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis / R. Khandpur, C. Carmona-Rivera, A. Vivekanandan-Giri et al. // Sci Transl Med. – 2013. – Vol. 5(178). – P. 178ra40.

4. Участие внеклеточных ДНК-ловушек в защитных и патологических реакциях организма/ И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, И.В. Курносенко и др. // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т. 9 (18), № 2. – С. 164–170.

5. Yousefi S. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps / S. Yousefi, C. Mihalache, E. Kozlowski et al. // Cell Death Differ. – 2009. – Vol. 16. – P. 1438–1444.

6. The Role of Reactive Oxygen Species (ROS) in the Formation of Extracellular Traps (ETs) in Humans / W. Stoiber, A. Obermayer, P. Steinbacher, W.-D. Krautgartner // Biomolecules. – 2015. – Vol. 5. – P. 702–723.

7. 2010 Rheumatoid arthritis classification criteria. An American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative / D. Aletaha, T. Neogri, A.J. Silman et al. // Arthritis Rheum. – 2010. – Vol. 62. – P. 2569–2581.

8. Медицинские лабораторные технологии: руководство по клинической лабораторной диагностике: в 2 т. / В.В. Алексеев [и др.]; под ред. А.И. Карпищенко. – 3-е изд., перераб. и доп. – Т. 1. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 472 с.

9. Мартемьянов В.Ф. Клиническое значение исследования активности ферментов и изоферментов пуринового метаболизма в плазме крови больных анкилозирующим спондилитом / В.Ф. Мартемьянов, Е.Э. Мозговая, С.А. Бедина // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 12–6. – С. 1048–1052.

10. Особенности пуринового метаболизма при ревматоидном артрите, остеоартрозе и подагрическом артрите / В.Ф. Мартемьянов, Е.Э. Мозговая, М.Ю. Стажаров, С.А. Бедина // Вестник Смоленской медицинской академии. – 2004. – № 5. – С. 65–69.

11. Энзимодиагностика активности патологического процесса при ревматоидном артрите / Е.Э. Мозговая, В.Ф. Мартемьянов, М.Ю. Стажаров, С.А. Бедина // Врач-аспирант. – 2011. – Т. 47, № 4. – С. 45–50.

12. Mechanism of the Conversion of Xanthine Dehydrogenase to Xanthine Oxidase. Identification of the two cysteine disulfide bonds and crystal structure of a non-convertible rat liver xanthine dehydrogenase mutant / T. Nishino, K. Okamoto, Y. Kawaguchi et al. // J. Biol. Chem. – 2005. – Vol. 280. – P. 24888–24894.

13. Кожемякин Л.А. Ксантиноксидазная активность тимоцитов при лимфоцитолитическом действии гипоксантина / Л.А. Кожемякин, E.П. Шелепина, В.Г. Антонов // Вопросы медицинской химии. – 1990. – Т. 36, Вып. 1. – С. 87–89.

14. Harris C.M. The Reaction of Reduced Xanthine Dehydrogenase with Molecular Oxygen. Reaction kinetics and measurement of superoxide radical / C.M. Harris, V. Massey // J. Biol. Chem. 1997. – Vol. 272. – P. 8370–8379.

15. Надеев А.Д. Активные формы кислорода в клетках сердечно-сосудистой системы / А.Д. Надеев, Н.В. Гончаров // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. – 2014. – № 4. – С. 80–94.

Ревматоидный артрит (РA) является хроническим аутоиммунным заболеванием, характеризующимся наличием ревматоидного фактора (РФ) и антител к циклическому цитруллинированному пептиду.

Из всех иммуновоспалительных ревматических заболеваний РА относится к категории наиболее распространенных и социально значимых болезней. Им болеет от 0,5 % до 2 % взрослого населения нашей планеты, причем около 70 % – это женщины. РА поражает людей молодого, трудоспособного возраста и характеризуется тяжелым течением, ранней инвалидностью, снижением качества жизни, неблагоприятным прогнозом. Это одно из самых дорогостоящих заболеваний, что ведет к значительной социально-экономической нагрузке как на самого больного, так и на общество в целом. Кроме того, РА сопровождается коморбидными состояниями: кардиоваскулярными (инфаркт миокарда, инсульт, тромбоз сосудов), онкологическими, инфекционными, с развитием которых связан высокий риск преждевременного летального исхода. Основными составляющими элементами борьбы с РА являются: ранняя и своевременная диагностика, выяснение этиопатогенетических механизмов развития заболевания, профилактика и адекватное лечение. На современном этапе ко многим аспектам еще остаются вопросы. Поэтому исследования РА не потеряли своей актуальности и в настоящее время.

На сегодняшний день нет единого взгляда на этиопатогенез РА. Существует множество теорий развития заболевания. Но большинство исследователей склоняются к тому, что РА – многофакторное заболевание и в его возникновении и прогрессировании участвуют как минимум 3 фактора: инфекционный, иммуногенетический и аутоиммунный.

Наметившийся в XXI веке прогресс в плане раскрытия механизмов патогенеза связан с выяснением некоторых звеньев аутоиммунного ответа. В результате этого появилась возможность поиска новых лекарственных препаратов, направленных на блокирование отдельных патогенетических звеньев. Однако единая, научно обоснованная, концепция патогенеза РА так и не разработана. Поэтому окончательную точку в этом вопросе ставить еще рано.

В последние годы мировым научным сообществом активно обсуждается роль NETоза (процесса образования нейтрофилами внеклеточных ловушек) в возникновении и прогрессировании различных патологических состояний организма, в том числе и аутоиммунных [1].

Высказываются гипотезы, что компоненты экстрацеллюлярных ловушек могут выступать этиологическим фактором, инициируя аутоиммунное воспаление при РА, а также способствуют его хронизации, выступая в качестве факторов аутоагресии [2, 3].

Фактически ловушки представляют собой сетеподобные структуры, сотканные из нитей ядерной ДНК, гистонов, цитоплазматических белков и компонентов гранул нейтрофилов [4]. Следовательно, функция ДНК заключается не только в хранении и передаче генетического материала, но и в защите организма от различных экзогенных и эндогенных патогенов. Обычно этот процесс сопровождается смертью нейтрофилов.

Сравнительно недавно был описан механизм образования ловушек нейтрофилами, который не приводит их к гибели. В состав таких экстрацеллюлярных ловушек входила митохондриальная ДНК [5].

Чаще всего NETоз происходит при участии активных форм кислорода (АФК) – это так называемый АФК-зависимый NETоз. Интенсивность образования нейтрофильных внеклеточных ловушек зависит от генерации АФК и активности НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы [6].

АФК также образуются и в ходе деградации пуриновых метаболитов. Одной из таких реакций является окисление гипоксантина и ксантина в присутствии ксантиноксидазы. Ксантиноксидаза – ведущий прооксидантный фермент. Литературных данных о повреждающем воздействии АФК на ДНК много [1–4, 6]. А роль прооксидантных ферментных систем в механизмах NETоза выяснена недостаточно.

Цель исследования: изучить профиль ксантиноксидазы (КО) и ксантиндегидрогеназы (КДГ) в плазме крови и циркулирующих лимфоцитах у больных РА серонегативных и серопозитивных по ревматоидному фактору.

Материалы и методы исследования

В исследование были включены 75 (52 женщины и 23 мужчины) больных РА и 35 практически здоровых людей. Отбор больных проводился в ревматологическом отделении ГКБ СМП № 25 г. Волгограда. Диагноз устанавливался на основе критериев, рекомендованных ACR/EULAR 2010 [7]. Средний возраст больных составил 43,9 ± 0,97 лет, средняя продолжительность заболевания – 8,5 ± 0,3 лет. Степень активности ревматоидного процесса определялась с использованием индекса DAS 28. I (минимальная) степень установлена у 15 (20 %), II (умеренная) – у 49 (65,3 %) и III (максимальная) – у 11 (14,7 %) больных. Первая рентгенологическая стадия поражения суставов по Штейнброкеру определялась у 8 (9,7 %), II – у 53 (57,6 %), III – у 25 (27,2 %), IV – 6 (6,5 %) больных. У всех больных наблюдалось ограничение функциональных возможностей суставов: I функциональный класс (ФК-1) установлен у 30 (40 %) больных, ФК-2 – у 40 (53,3 %) и ФК-3 – у 5 (6,7 %) больных. Серопозитивная форма РА наблюдалась у 49 (65,3 %) больных, серонегативная – у 26 (34,7 %). Суставная форма обнаружена у 44 (58 %) больных РА. У 31 (41,3 %) больного выявлены системные поражения. Из внесуставных поражений наиболее часто диагностировалась патология мышц (31,3 %), сердца (27,5 %), желудочно-кишечного тракта (26,3 %), почек (13,8 %).

Комплексное медикаментозное лечение больных РА включало нестероидные противовоспалительные средства: индометацин, диклофенак, мовалис, кетопрофен, мелоксикам, напроксен, целекоксиб и др.; базисную терапию: метотрексат, сульфасалазин, инфликсимаб, лефлуномид, гидроксихлорохин; глюкокортикоиды. Лечение проводилось с учетом клинических особенностей заболевания, степени активности процесса, характера течения, внесуставных поражений.

Объектами исследований служили плазма и лизаты лимфоцитов периферической крови здоровых лиц и больных РА. Лимфоциты из венозной крови выделяли по методике Boyum методом дифференциального центрифугирования с использованием лимфосепа (Lympho separation medium) фирмы «JCN Biomedicals» в градиенте плотности 1,077–1,079 г/мл [8]. Лизаты клеток готовили путем трехкратного замораживания-оттаивания с последующим центрифугированием. Активность ксантиноксидазы (КО; Е.С. 1.17.3.2) и ксантиндегидрогеназы (КДГ; Е.С. 1.17.1.4) в плазме и лизатах лимфоцитов определяли спектрофотометрическим методом по ранее опубликованным методикам и выражали в нмоль/мин/мл [9]. Для лизатов лимфоцитов активность приводили к содержанию клеток 1×107 на 1 мл.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программного пакета Statistica 6.0. Результаты выражали как среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (М ± m). Подбор критериев для сравнения групп осуществляли по общепринятым правилам. Достоверными различия считались при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Обследовано 35 практически здоровых людей в возрасте от 18 до 55 лет, среди которых было 24 (68,6 %) женщин и 11 (31,4 %) мужчин; средний возраст – 37,2 ± 2,18 лет. Существенной зависимости активности энзимов от пола и возраста выявлено не было, что позволило в дальнейших исследованиях эти факторы не учитывать. Референтные пределы активности ферментов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Референтные пределы активности ферментов в плазме крови и лизатах лимфоцитов

У больных РА (группа в целом) по сравнению с референтной группой (табл. 2) в плазме выявлено повышение активности КО, незначительное снижение активности КДГ; в лизатах лимфоцитов – снижение активности КО, КДГ. В своих более ранних работах нами была обнаружена зависимость активности КО и КДГ от активности патологического процесса [10, 11]. Поскольку РФ выполняет роль индикатора воспалительного процесса и аутоиммунных нарушений, мы предположили, что наличие РФ может также оказывать влияние на энзимный профиль крови.

У больных РА с серопозитивной формой по сравнению с контрольной группой (табл. 2) в плазме выше активность КО и КДГ, в лимфоцитах активность КО и КДГ ниже. У больных РА с серонегативной формой (табл. 2) в плазме крови выше активность КО, но ниже активность КДГ, а в лимфоцитах активность обоих ферментов снижена.

Сравнение этих двух форм РА показало, что у больных с серопозитивной по сравнению с серонегативной формой (табл. 2) в плазме выше активность КО, КДГ, в лимфоцитах ниже активность КО и КДГ.

Таким образом, проведенные нами исследования выявили зависимость изученных энзимных показателей от наличия или отсутствия РФ. Показано, что у больных с серопозитивной формой РА активность КО в плазме крови повышена в большей степени, чем при серонегативном варианте, а активность КДГ, сниженная при серонегативной форме РА, повышается у больных с серопозитивным РА. В лизатах лимфоцитов активность КО и КДГ снижена и при серопозитивной, и при серонегативной формах РА, но наиболее выраженные изменения активности энзимов обнаружены у больных РА с серопозитивной формой. КО и КДГ – две взаимопревращающиеся формы ксантиноксидоредуктазы. Уникальный ферментный комплекс ксантиноксидаза/ксантиндегидрогеназа является одной из главных систем генерирования активных форм кислорода в организме. Трансформация фермента в кислород-зависимую форму – КО запускается разными механизмами [12]. Активация КО-реакции приводит к генерации супероксидных радикалов, которые оказывают токсическое воздействие на хроматин и белки ядра клетки и запускают генетически запрограммированную гибель клеток – апоптоз [13]. Кроме того, в условиях дефицита NAD+, возникающего при воспалении, КДГ также может генерировать супероксид, еще до трансформации КДГ в КО [14]. По мнению исследователей, важную роль в модуляции клеточного баланса между КДГ и КО играет НАДФН-оксидаза. АФК, продуцируемые НАДФН-оксидазой, стимулируют превращение ксантиноксидоредуктазы из ее дегидрогеназной формы (КДГ) в оксидазную (КО) [15].

По данным современных научных исследований, наряду с интерлейкинами и липополисахаридами, образование нейтрофильных внеклеточных ловушек провоцирует и РФ [2].

Таким образом, исходя из полученных нами данных, мы можем предположить, что в развитии и прогрессировании аутоиммунного процесса при РА активное участие принимают прооксидантные энзимные системы, что не противоречит и литературным данным.

В настоящее время все еще остается непонятным механизм переключения между различными эффекторными программами лейкоцитов. Высказывается предположение, что NETоз является резервным механизмом в программе активной контролируемой клеточной гибели нейтрофилов и запускается после неудачного фагоцитоза, апоптоза [4].

Лечение РА препаратами нового поколения позволяет контролировать течение заболевания и значительно улучшить качество жизни больных. Но, несмотря на успехи в этом направлении, достигнуть необходимого терапевтического результата удается не всегда. Вероятно, это связано с тем, что не все патогенетические механизмы, поддерживающие воспалительный процесс, выяснены на данный момент. Дальнейшее изучение патогенетических путей и создание новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов, направленных на блокирование патологических реакций, остается актуальной задачей современной медицины.

Выводы

1. Для энзимного профиля больных РА характерно повышение активности КО в плазме крови и снижение активности КО и КДГ в лимфоцитах.

2. Наиболее выраженные изменения активности энзимов обнаружены у больных РА с серопозитивной формой.

Библиографическая ссылка