Научный журнал

Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,556

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Копытько Я.Ф. 1

---

1 ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений

Маклейя сердцевидная (Macleaya cordata (Willd.) R. Br.) и маклейя мелкоплодная (Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde) являются источниками изохинолиновых алкалоидов (сангвинарина, хелеретрина, протопина, аллокриптопина и др.), которые идентифицируют различными хроматографическими методами. Целью исследования является качественное обнаружение протопина в образцах травы маклейи методом газо-жидкостной хромато-масс-спектрометрии на хромато-масс-спектрометре 450GC-220MS (Varian, США) с масс-анализатором типа «ионная ловушка», с кварцевой капиллярной колонкой FactorFour VF-5ms (30 м × 0,25 мм). В качестве испытуемого раствора использовали спиртовое извлечение из травы. В результате проведенного анализа качественно обнаружены протопиновые алкалоиды. Для оптимизации хроматографического разделения алкалоидных соединений проведен подбор температурной программы, выявлено, что протопиновые алкалоиды образуют паровую фазу при температуре 240 °С, как соединения близкой химической структуры, они выходят близко расположенными пиками. Выявлено, что в спиртовых извлечениях из образцов обоих видов маклейи превалируют протопин и аллокриптопин, причем в таковом из M. сordata содержание этих соединений заметно выше, чем в M. microcarpa, что явствует из площадей пиков. Отношение содержаний протопина и аллокриптопина, вычисленное по площадям пиков, составляет в лекарственном растительном сырье маклейи сердцевидной – 1,6, в мелкоплодной – 1,3. Предложенная методика и полученные результаты позволяют использовать их при количественной оценке в пересчете на стандартный образец при его наличии. В извлечении из M. сordata также найден алкалоид дигидронитидин. Наряду с алкалоидами в обеих пробах обнаружено азогетероциклическое соединение – 2,4-диамино-7,8,9,10-тетрагидро-11-(3-пиридил)пиримидо[5’,4’:2’,3’]тиено[5,4-b]хинолин, которое может не являться нативным, так как при высоких температурах могут происходить различные процессы, приводящие к появлению дериватов и артефактов, а также бензо[f]бензимидазоло[2,1-b]бензотиазол и 4-амино-2-[p-(диметиламино)фенил]-5H-1]бензопирано[4,3-d]пиримидин-5-он, которые могут как быть нативными соединениями, так и являться артефактами.

Статья в формате PDF

1030 KB

Macleaya cordata

Macleaya microcarpa

протопин

ГЖХ-МС

1. Абизов Е.А., Толкачёв О.Н., Копылова И.Е., Луферов А.Н. Распределение суммы алкалоидов сангвинарина и хелеритрина в надземной части Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde (Papaveraceae) // Химико-фармацевтический журнал. 2003. Т. 37 (8). С. 18–19.

2. Lin L., Liu Y.C., Huang J.L., Liu X.B., Qing Z.X., Zeng J.G., Liu Z.Y. Medicinal plants of the genus Macleaya (Macleaya cordata, Macleaya microcarpa): A review of their phytochemistry, pharmacology, and toxicology // Phytother Res. 2018. Vol. 32 (1). P. 19–48. DOI: 10.1002/ptr.5952.

3. Huang J., Yue M., Yang Y., Liu Y., Zeng J. Protopine-Type Alkaloids Alleviate Lipopolysaccharide-Induced Intestinal Inflammation and Modulate the Gut Microbiota in Mice // Animals (Basel). 2024. Vol. 14 (15). P. 2273. DOI: 10.3390/ani14152273.

4. Dong Z., Wang Y.H., Tang Z.S., Li C.H., Jiang T., Yang Z.H., Zeng J.G. Exploring the Anti-inflammatory Effects of Protopine Total Alkaloids of Macleaya cordata (Willd.) R. Br. // Front Vet Sci. 2022. Vol. 9. № 6. P. 935201. DOI: 10.3389/fvets.2022.935201.

5. Petruczynik A., Plech T., Tuzimski T., Misiurek J., Kaproń B., Misiurek D., Szultka-Młyńska M., Buszewski B., Waksmundzka-Hajnos M. Determination of Selected Isoquinoline Alkaloids from Mahonia Aquifolia; Meconopsis Cambrica; Corydalis Lutea; Dicentra Spectabilis; Fumaria Officinalis; Macleaya Cordata Extracts by HPLC-DAD and Comparison of Their Cytotoxic Activity // Toxins (Basel). 2019. Vol. 11 (10). P. 575. DOI: 10.3390/toxins11100575.

6. Nie C., Wang B., Wang B., Lu N., Yu R., Zhang E. Protopine triggers apoptosis via the intrinsic pathway and regulation of ROS/PI3K/Akt signalling pathway in liver carcinoma // Cancer Cell Int. 2021. Vol. 21 (1). P. 396.

7. Lu L., Pang M., Chen T., Hu Y., Chen L., Tao X., Chen S., Zhu J., Fang M., Guo X., Lin Z. Protopine Exerts Neuroprotective Effects on Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage in Rats via Activation of the AMPK/PGC1α Pathway // Drug Des Devel Ther. 2024. Vol. 18. P. 4975–4992. DOI: 10.2147/DDDT.S484969.

8. Pěnčíková K., Urbanová J., Musil P., Táborská E., Gregorová J. Seasonal Variation of Bioactive Alkaloid Contents in Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde // Molecules. 2011. Vol. 16. P. 3391–3401. DOI: 10.3390/molecules16043391.

9. Zhou X., Peng Y., Zhou H., Wang W., Yi G., Xia Q., Guo Y., Xie L. Profiling 32 alkaloid compounds from Macleaya cordata by UPLC-DAD-QTOF-MS/ms // Nat Prod Res. 2024. P. 1–8. DOI: 10.1080/14786419.2024.2408409.

10. Huang W., Kong L., Cao Y., Yan L. Identification and Quantification, Metabolism and Pharmacokinetics, Pharmacological Activities, and Botanical Preparations of Protopine: A Review // Molecules. 2022. Vol. 27 (1). P. 215. DOI: 10.3390/molecules27010215.

11. Berkov S., Bastida J., Nikolova M., Viladomat F., Codina C. Rapid TLC/GC-MS identification of acetylcholinesterase inhibitors in alkaloid extracts // Phytochem Anal. 2008. Vol. 19. № 5. P. 411–419. DOI: 10.1002/pca.1066.

12. Dong Z., Liu M., Zhong X., Ou X., Yun X., Wang M., Ren S., Qing Z., Zeng J. Identification of the Trace Components in Bopuzong Jian and Macleaya cordata Extract Using LC-MS Combined with a Screening Method // Molecules. 2021. Vol. 26 (13). P. 3851. DOI: 10.3390/molecules26133851.

13. Qing Z.X., Cheng P., Liu X.B., Liu Y.S., Zeng J.G. Systematic identification of alkaloids in Macleaya microcarpa fruits by liquid chromatography tandem mass spectrometry combined with the isoquinoline alkaloids biosynthetic pathway // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2015. Vol. 103. P. 26–34.

14. Suau R., Cabezudo B., Rico R., Nájera F., López-Romero J.M. Direct determination of alkaloid contents in Fumaria species by GC-MS // Phytochem Anal. 2002. Vol. 13 (6). P. 363–367. DOI: 10.1002/pca.669.

15. Fafal T., Önur M.A. Determination of protopine in Fumaria densiflora DC by TLC densitometric bnd spectrofotometric method // Ankara Ecz. Fak. Derg. 2007. Vol. 36 (4). P. 223–235.

16. Suau R., Cabezudo B., Valpuesta M., Posadas N., Diaz A., Torres G. Identification and quantification of isoquinoline alkaloids in the genus Sarcocapnos by GC-MS. // Phytochem. Anal. 2005. Vol. 16. P. 322–327.

17. Gao X., Liu J., Zuo X., Feng X., Gao Y. Recent Advances in Synthesis of Benzothiazole Compounds Related to Green Chemistry // Molecules. 2020. Vol. 25 (7). P.1675. DOI: 10.3390/molecules25071675.

Введение

Маклейя сердцевидная (Macleaya cordata (Willd.) R. Br.) и маклейя мелкоплодная (Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde) сем. маковые – Papaveraceae являются источниками изохинолиновых алкалоидов, обладающих важными фармакологическими свойствами – седативным, психотропным, обезболивающим, противомикробным и противовоспалительным действием. Лекарственное растительное сырье (ЛРС) маклейи используется для получения препарата Сангвиритрина – суммы бисульфатов бензо[c]фенантридиновых алкалоидов сангвинарина и хелеритрина, обладающих противомикробным действием [1, 2].

В надземной части маклейи среди алкалоидов превалируют сангвинарин и хелеретрин, сумма которых составляет в листьях образцов растений, выращенных в России (ВИЛАР), до 2,01 %; в листьях M. cordata из Польши – 3,1 и 5,6 мг/г, в траве – 0,7 и 1,8 сангвинарина и хелеритрина соответственно. Также содержатся алкалоиды протопинового типа среди которых превалируют протопин (до 35 %) и аллокриптопин (до 15 %), которые характеризуются выраженным противовоспалительным действием. В образцах листьев M. cordata протопина найдено 1,76 мг/г, в траве – 0,47 мг/г [3–5]. Протопина гидрохлорид, изохинолиновый алкалоид, является специфическим обратимым и конкурентным ингибитором ацетилхолинэстеразы, проявляет противовоспалительную, антимикробную, антиангиогенную, нейропротективную и противоопухолевую активность [3, 6, 7].

Скрининг биологически активных веществ, их качественное и количественное определение требует использования высокоселективных физико-химических методов. Для анализа алкалоидных соединений маклейи используются различные хроматографические методы. ВЭЖХ – квадрупольная времяпролетная масс-спектрометрия чаще всего используется для комплексных исследований сырья и лекарственных средств растительного происхождения. С помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с тандемным масс-селективным детектированием в экстракте маклейи сердцевидной были идентифицированы 32 алкалоида, в том числе 16 минорных алкалоидных соединений, включая нандазурин, гидроксихелидонин, капауридин, (-)-дицентрин, лептопин, адлумидин, такатонин и др. [8, 9].

Протопин также может быть идентифицирован и количественно определен методами газо-жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ГЖХ-МС) и тонкослойной хроматографией в комбинации с ГЖХ-МС (ТСХ/ГЖХ-МС). По сравнению с высокоэффективной жидкостной хроматографией в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) или высокоэффективной жидкостной хроматографией, соединенной с методом ядерного магнитного резонанса (ВЭЖХ-ЯМР), ТСХ/ГХ-МС имеет преимущества в виде короткого времени анализа, низкой стоимости разделения и простоты определения. ТСХ/ГХ-МС больше подходит для быстрого скрининга большого количества образцов небольшой массы из растений, содержащих алкалоиды [10]. Для анализа алкалоидов в экстрактах применялся также биоавтографический анализ ТСХ, совместно с препаративной ТСХ и ГХ-МС [11].

С помощью метода ВЭЖХ выявлено, что доминирующим алкалоидом маклейи сердцевидной, культивируемой в Чехии, является аллокриптопин (3,8–13,6 и 24,2–48,9 мг/г соответственно для надземной и подземной частей). Также присутствовали хелеритрин (2,9–5,7 и 3,6–10,7 мг/г соответственно для надземной и подземной частей), сангвинарин ( 2,9–4,3 и 2,9–10,1 мг/г) и протопин (1,1–5,1 и 0,8–5,8 мг/г для надземной и подземной частей соответственно [5]. Методом ВЭЖХ-МС идентифицированы альфа-аллокриптопин и β-аллокриптопин в плодах M. cordata. В плодах M. cordata и M. microcarpa родом из Китая обнаружены хелидонин, криптонин, ваиллатин, 2-диметилмкрамин, гуннеманнин, корикавидин, мурамин, корикавамин, 2,3-диметилэритопин [2, 12].

Определение алкалоидного состава также проводится с помощью других методов инструментального тестирования, таких как газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС), капиллярный электрофорез-масс-спектрометрия и ВЭЖХ-ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Для разделения и анализа изохинолиновых алкалоидов (протопин, криптопин, синактин, стилопин, бикукуллин, адлюмин, парфумин, фумарилин, фумарофицин, фумаритин, дигидрофумарилин, парфумидин и дигидросангвинарин) успешно применяется метод ГЖХ-МС с использованием хромато-масс-спектрометра Hewlett Packard 5988A MS – HP 5980 GC, оснащенного капиллярной колонкой HP-1 (12 м × 0,2 мм; толщина пленки 0,33 м). Температурная программа колонки: 200 °C в течение 0,8 мин, увеличение со скоростью 10 °C/мин до 250 °C, затем 250 °C в течение 24 мин. Алкалоиды извлекали из ЛРС последовательно экстракцией метанолом, затем выпариванием растворителя, растворением полученного остатка в кислоте хлористоводородной 2,5 %, фильтрацией и подщелачиванием до pH 8 концентрированным аммиаком, экстракцией дихлорметаном [13]. Протопин количествено определяли методом ТСХ с денситометрией и спектрофотометрии в системе растворителей толуол – хлороформ-метанол – 25 % аммиак (5:3:1:1) и циклогексан – диэтиламин (9:1) [14].

Изохинолиновые алкалоиды протопин, криптопин, синактин, стилопин, бикукуллин, адлюмин, парфумин, фумарилин, фумарофицин, фумаритин, дигидрофумарилин, парфумидин и дигидросангвинарин были определены и идентифицированы методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии в видах Fumaria и Sarcocapnos [15, 16].

Цель исследования – качественное обнаружение протопина в траве Macleaya cordata и Macleaya microcarpa методом ГЖХ-МС.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили образцы травы M. cordata и M. microcarpa, выращенных на опытных полях Средне-Волжского филиала ФГБНУ ВИЛАР в 2023 г.

Подготовка пробы: около 1 г (точная навеска) сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 7 мм, помещают в коническую колбу со шлифом объемом 150 мл, прибавляют 50 мл 70 % спирта, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры, полученное извлечение фильтруют в колбу объемом 50 мл через бумажный складчатый фильтр.

Анализ проводили методом ГЖХ-МС на хромато-масс-спектрометре 450GC-220MS (Varian, США) с масс-анализатором типа «ионная ловушка». Хроматографическое разделение компонентов пробы проводили на кварцевой капиллярной колонке FactorFOUR VF-5ms (30 м × 0,25 мм). Газ-носитель – гелий с постоянной скоростью потока 1,0 мл/мин. В инжектор хроматографа при температуре 200 °С (деление потока 5) вводят по 1 мкл пробы. Температурная программа колонки: 150 °С – 1 мин, нагрев до 240 °С – 10 °С/мин, изотерма при 240 °С – 30 мин. Включение ионизации на 4-й мин. Общее время анализа – 40 мин.

Идентификацию разделенных компонентов проводили с использованием библиотеки масс-спектров (NIST-08 MS Library and MS Search Program, Version 2f) и алгоритмов сравнения программного обеспечения Saturn (Varian). Количественную оценку осуществляли методом нормализации по площади пиков (полный ионный ток) идентифицированных соединений с использованием автоматической системы обработки.

Результаты исследования и их обсуждение

Всех соединений в пробах, включая неидентифицированные, насчитывается более 90 (рисунок). С помощью анализа методом ГЖХ-МС в извлечениях из ЛРС маклейи обнаружено шесть азотсодержащих соединений (таблица). Также в извлечениях были найдены соединения других классов – углеводороды С21–С25, дитерпеновый спирт фитол, который присутствует во всех зеленых растениях, эфиры фталевой кислоты, часто встречающиеся в извлечениях из ЛРС, что может быть обусловлено загрязнением почвы и воды пластиком.

Для оптимизации хроматографического разделения алкалоидных соединений проведен подбор температурной программы, выявлено, что протопиновые алкалоиды образуют паровую фазу при температуре 240 °С, как соединения близкой химической структуры они выходят близко расположенными пиками. Выявлено, что в извлечении из образцов обоих видов маклейи превалируют протопин и аллокриптопин, причем в таковом из M. сordata содержание этих соединений заметно выше, чем в M. microcarpa, что явствует из площадей пиков. Отношение содержаний протопина и аллокриптопина, вычисленное по площадям пиков, составляет в ЛРС маклейи сердцевидной – 1,6, в мелкоплодной – 1,3. Предложенная методика и полученные результаты позволяют использовать их при количественной оценке в пересчете на стандартный образец при его наличии.

В обеих пробах найдено азогетероциклическое соединение 2,4-диамино-7,8,9,10-тетрагидро-11-(3-пиридил)пиримидо[5’,4’:2’,3’]тиено[5,4-b]хинолин, оно может не являться нативным, так как при высоких температурах могут происходить различные процессы, приводящие к появлению дериватов и артефактов, которых нет в ЛРС, а именно окисление и другие процессы, приводящие к деградации соединений, перегруппировкам и т.д. В извлечении из M. сordata также найдены алкалоид дигидронитидин, а также бензо[f]бензимидазоло[2,1-b]бензотиазол и 4-амино-2-[p-(диметиламино)фенил]-5H-1]бензопирано[4,3-d]пиримидин-5-он, которые также могут как быть нативными соединениями, так и являться артефактами.

Протопиновые алкалоиды и азотсодержащие соединения Macleaya, идентифицированные методом ГЖХ-МС

Источник: составлено автором на основе полученных данных в ходе исследования.

Хроматограммы извлечений из Macleaya cordata (верхняя) и Macleaya microcarpa (нижняя) Источник: составлено автором по результатам данного исследования

Существование в растении второго соединения из вышеуказанных вполне возможно, так как известно, что кольцевая система бензотиазола первоначально была обнаружена в различных морских и других природных соединениях, такие соединения широко используются в качестве антиоксидантов, регуляторов роста растений, противовоспалительных средств, ингибиторов ферментов и др. благодаря своей высокой фармацевтической и биологической активности [17].

Заключение

Предложена методика качественного обнаружения протопиновых алкалоидов в образцах травы маклейи методом ГЖХ-МС. При наличии стандартного образца анализируемые вещества можно оценивать количественно.

В извлечениях из ЛРС M. cordata и M. microcarpa обнаружено шесть азотсодержащих соединений – протопиновые алкалоиды – протопин и аллокриптопин, дигидронитидин обнаружен только в извлечении из ЛРС M. cordata.

В обеих пробах найдено азогетероциклическое соединение 2,4-диамино-7,8,9, 10-тетрагидро-11-(3-пиридил)пиримидо[5’,4’:2’,3’]тиено[5,4-b]хинолин, а также бензо[f]бензимидазоло[2,1-b]бензотиазол и 4-амино-2-[p-(диметиламино)фенил]-5H-1] бензопирано[4,3-d]пиримидин-5-он, которые также могут как быть нативными соединениями, так и являться артефактами.

Библиографическая ссылка