Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,686

ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ВУЛЬВЫ

Неродо Г.А. 1 Горошинская И.А. 1 Иванова В.А. 1 Сурикова Е.И. 1 Качесова П.А. 1 Шалашная Е.В. 1 Неродо Е.А. 1 Немашкалова Л.А. 1 Леонова А.В. 1
1 ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России
Проведен сравнительный анализ интенсивности окислительных процессов и состояния антиоксидантной системы крови у 71 больной раком вульвы в возрасте 37 – 87 лет I-IV стадии заболевания, из которых у 30 был выявлен первичный рак, у 21 – рецидив заболевания и 20 находились в третьей клинической группе (состояние ремиссии). В плазме крови исследованы интенсивность хемилюминесценции, активность каталазы, церулоплазмина, содержание продуктов пероксидации липидов и белков. При достижении ремиссии происходит снижение интенсивности свободно-радикальных процессов и перекисного окисления липидов, восстановление структурно-функционального состояния мембран эритроцитов, при рецидивировании отмечается повышение активности каталазы, увеличение содержания церулоплазмина, снижение активности супероксиддисмутазы и усиление активности глутатионпероксидазы.
рак вульвы
ремиссия
рецидив
свободно-радикальное окисление
антиоксидантная система
окислительная модификация белков
1. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма // Методические рекомендации. СПб, 2000. – 104 с.
2. Арчаков А.И., Мохосеев И.М., Модификация белков активными формами кислорода и их распад // Биохимия. – 1989. – Т.54. – Вып.2. – С.179-186.
3. Ашрафян Л.А., Харченко Н.В., Киселёв В.И., Свешников П.Г. Рак вульвы: этиопатогеническая концепция. – М.: Практическая медицина, 2006. – 192 с.
4. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. – М.: Наука, 1989. – 276 с.
5. Камышников В.С., ред. Методы клинических лабораторных исследований. 6-е изд. – М.: МЕДпресс-информ, 2013. – 736 с.
6. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий. Обзор // Биохимия. – 2001. – Т.66. – Вып. 5. – С. 592-609.
7. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З., Бондарь И.А., Труфакин В.А. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. – М.: АРТА, 2008. 284 с.
8. Неродо Г.А., Иванова В.А., Неродо Е.А. Сроки возникновения рецидивов рака вульвы и их прогностические факторы // Современные проблемы науки и образования. – 2013. -№1. – URL:www.science-education.ru/107-8442 (дата обращения: 14.02.2014).
9. Новицкий В.В., Степовая Е.А., Гольдберг В.Е., Колосова М.В. Структурно-метаболический статус и функциональное состояние эритроцитов у онкологических больных//Паллиативная медицина и реабилитация. – 2000. – № 1-2. – С. 80.
10. Турчак А.В. Рецидивы рака вульвы и результаты их терапии (20 летний опыт) // Онкология. – 2009. – Т.11. – №4. – С.312-313.
11. Шестаков В.А., Бойчевская Н.О., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция плазмы крови в присутствии перекиси водорода // Вопр. мед. химии. 1979. Т.25. Вып.2.С.132-137.
12. Barrera G. Oxidative Stress and lipid Peroxidation Products in Cancer Progression and Therapy//ISRN Oncology/ -2012/ Article ID 137289, 21 pages.
13. Lushchak V.L., Gospodaryov D.V. Catalases protect cellular proteins from oxidative modification in Saccharomyces cerevisiae // Cell Biol.Int. -2005. -Vol.29. -№3 -P.187-192.
14. Stadman E.R. Metal ion – catalyzed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological conseguences // ree Rad .Biol. Med. – 1990. – V.9. – P. 315-325.

Рак вульвы является заболеванием весьма агрессивным, так как в силу своей анатомо-топографической особенности часто рецидивирует и рано метастазирует. По данным литературы частота рецидивирования рака вульвы составляет от 30 % до 60 %. Несмотря на визуальную доступность органа к осмотру более половины больных поступают для лечения с III-IVстадиями заболевания, что затрудняет возможность проведения адекватной терапии, в связи с чем имеется низкая эффективность лечения и 5-летняя выживаемость больных раком вульвы не превышает 50 % [3, 8, 10].

Патогенетическая роль свободнорадикальных процессов в возникновении и развитии онкозаболеваний в настоящее время общепризнана. Известно, что на разных этапах злокачественной прогрессии происходят фазные изменения свободнорадикального окисления и антиокислительной активности как в самой опухоли, так и в других органах и тканях, в первую очередь в крови. В связи с этим, исследование окислительного метаболизма в крови больных раком вульвы может дать дополнительную информацию об особенностях функционального состояния организма в зависимости от клинического течения заболевания [6, 7, 12].

Цель исследования. Провести сравнительное исследование интенсивности свбоднорадикального окисления и активности антиоксидантной системы защиты в крови больных раком вульвы на различных этапах развития данной патологии (первичный рак, состояние ремиссии и рецидив заболевания).

Материалы и методы исследования

Исследование состояния свободнорадикальных окислительных процессов в крови было проведено у 71 женщины раком вульвы I–IV стадии (I –22 %, II – 62 %, III –15 %, IV –1 %) в возрасте от 37 до 87 лет (средний возраст составил 66,7±1,3 лет, 88 % женщин находились в возрасте 51–80 лет) проходивших лечение в стационаре и находящихся на мониторинге в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава РФ. Из них на момент обследования у 30 был выявлен первичный рак вульвы, у 21 – рецидив рака вульвы, 20 находились в третьей клинической группе в длительной ремиссии – от 3 до 13 лет. Контрольную группу (группу доноров) составили 30 женщин без онкопатологии в возрасте от 34 до 73 лет (средний возраст 58,4±2,7 лет).

Для оценки интенсивности свободнорадикального окисления в плазме крови исследовали светосумму быстрой вспышки перекись-индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) [11], содержание продуктов реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных соединений) в пересчете на концентрацию малонового диальдегида (МДА), содержание карбонильных производных аминокислотных остатков, характеризующих окислительную модификацию белков (ОМБ), по методу R.L. Levin в модификации Е.Е. Дубининой. Индуцированную ОМБ стимулировали реактивом Фентона. Продукты реакции регистрировали спектрофотометрически при λ 370 нм. Состояние ферментативного звена антиоксидантной системы оценивали в плазме и в эритроцитах крови, определяя активность ферментов: каталазы, супероксиддисмутазы СОД, глутатионпероксидазы ГПО [1,5]. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов оценивали с использованием метода флуоресцентных зондов [4]. Содержание церулоплазмина определяли на биохимическом анализаторе COBAS INTEGRA 400 (Roche) иммунотурбидиметрическим методом.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistika 6.0, используя критерии Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни. Различия считали статистически достоверными при p<0,05 или имеющими тенденцию к достоверности при 0,1>р>0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

При изучении окислительного метаболизма в плазме крови больных раком вульвы было обнаружено, что светосумма перекись-индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции, отражающей интенсивность генерации супероксид-анион радикала (О2∙−) и гидроксильного радикала (НО) существенно превышала норму (табл. 1).

Таблица 1

Состояние свободнорадикальных процессов и антиоксидантной системы в плазме крови больных раком вульвы

Показатель

Группа

Контрольная (доноры)

n=30

Первичный

рак вульвы

n=30

3 клиническая группа

n=20

Рецидив

n=21

Каталаза, мкМ Н2О2/мин.

34,76±2,35

48,58±2,72

р1<0,001

52,31±4,9

р1<0,001

47,98±3,59

р1<0,01

МДА,

нМ/мл плазмы

290,8±27,3

581,8±46,6

р1<0,001

450,1±43,3

р1<0,001

623,0±61,5

р1<0,001

р3<0,05

Церулоплазмин,

г/л

0,295±0,023

0,340±0,027

0,301±0,025

0,358±0,025

0,1>р1>0,05

Светосумма хемилюминесценции плазмы крови,

имп./6 сек.

3950,4±375,2

11014,7±1576,8

р1<0,001

р3<0,01

5812,5±603,4

р1<0,01

12364,8±1999,0

р1<0,001

р3<0,01

ОМБ 370 нмспонт., мкМ/мг белка

23,58±2,39

28,24±2,34

20,91±1,89

25,86±2,34

ОМБ 370 нм инд., мкМ/мг белка

1080,0±95,1

939,7±42,2

р3<0,05

698,6±57,9

р1<0,01

р2<0,05

910,01±69,71

р3<0,05

Примечание.достоверность различий между группами: р1 – по сравнению с контрольной группой, р2 – по сравнению с группой с первичным раком вульвы, р3 – по сравнению с 3 клинической группой.

У больных первичным раком вульвы этот показатель был выше по сравнению с уровнем доноров в 2,8 раза, а у больных с рецидивом – в 3,1 раза (p<0,001). При этом следует отметить, что значение данного показателя у больных 3 клинической группы хотя и превышало контрольные значения в 1,5 раза, но было значительно ниже, чем у больных первичным раком вульвы и с рецидивом в 1,9 и 2,1 раза соответственно. Следовательно, рецидивирование рака вульвы происходит на фоне интенсификации процессов генерации свободных радикалов в плазме крови.

Защиту от повреждающего действия активных форм кислорода осуществляют в первую очередь ферменты-антиоксиданты. У всех обследованных больных раком вульвы отмечено увеличение активности каталазы: у больных с первичным раком вульвы и рецидивом на 39,8 и 38,0 % по сравнению с контролем, а у больных 3 клинической группы – на 50,5 % (табл. 1). Мы полагаем, что активация этого антиоксидантного фермента происходит в ответ на избыточную продукцию свободных радикалов в плазме крови больных раком вульвы и носит компенсаторный характер. Содержание основного антиоксиданта плазмы крови церулоплазмина было повышено на 21,4 % только у больных с рецидивами рака вульвы. В связи с тем, что основными функциями церулоплазмина являются регулирование обмена меди в крови и других тканях, а также участие в иммобилизации сывороточного железа [7], такая картина может свидетельствовать об активации метаболизма меди и железа, и, по всей видимости, способствует развитию рецидива.

Однако, несмотря на данный факт, исследование интенсивности процессов перекисного окисления липидов в плазме крови выявило их активацию во всех исследуемых группах больных раком вульвы, что проявилось в повышении содержания МДА. У больных с первичным раком вульвы значения данного показателя в 2 раза превышали соответствующие величины контрольной группы, а у больных с рецидивом были в 2,1 раза выше относительно нормы и на 38 % по сравнению со значениями у больных 3 клинической группы. Следует отметить, что у больных в ремиссии прирост содержания МДА был наименьшим – на 54 % выше уровня доноров.

В то же время изучение перекисного окисления белков по уровню продуктов окисления белковых молекул плазмы крови – карбонильных производных не выявило достоверных изменений в содержании спонтанно окисленных аминокислотных остатков. Полученные нами результаты могут быть обусловлены активацией каталазы, о чём в литературе имеются данные, указывающие на сильную обратную корреляцию между накоплением карбонильных групп и активностью каталазы [13].

Исследование металлкатализируемой ОМБ выявило достоверное снижение уровня карбонильных производных белков у больных 3 клинической группы как по сравнению с уровнем у доноров, так и у больных первичным раком вульвы и с рецидивом – на 35,3, 25,7 и 23,2 % соответственно (табл. 1). Поскольку уровень металлкатализируемой ОМБ рассматривается как величина, по которой можно судить о количестве субстрата окисления (доступных легко окисляемых групп) и возможности его вовлечения в этот процесс (доступных сайтов связывания ионов металлов) и, следовательно, об устойчивости системы к оксидативному стрессу [2,14], то более низкое значение показателя металлкатализируемого ОМБ у больных 3 клинической группы свидетельствует о меньшей окисляемости белков и большей устойчивости к окислительному повреждению, что в свою очередь может являться следствием конформационных изменений белковых молекул у больных этой группы.

Результаты исследования состояния антиоксидантной системы в эритроцитах крови больных раком вульвы представлены в табл. 2.

Таблица 2

Состояние антиоксидантной системы в эритроцитах крови больных раком вульвы

Показатель

Группа

Контрольная (доноры)

n=30

Первичный

рак вульвы

n=30

3 клиническая группа

n=20

Рецидив

n=21

СОД,

ед. актив./мг Hb

500,8±16,4

423,4±21,8

р1<0,01

424,2±28,9

р1<0,05

410,6±18,2

р1<0,001

Каталаза, мкМ Н2О2/мин.×мгHb

135,5±4,1

128,5±6,0

126,5±4,8

129,3±8,5

ГПО,

МЕ/мг Hb

243,5±23,0

369,0±24,1

р1<0,001

349,3±29,5

р1<0,05

364,1±24,8

р1<0,001

СОД/Каталаза

3,75±0,12

3,29±0,17

3,30±0,16

3,12±0,22

СОД/ГПО

2,50±0,23

1,10±0,08

р1<0,001

1,07±0,09

р1<0,001

1,33±0,19

р1<0,01

Каталаза/ГПО

0,726±0,092

0,363±0,029

р1<0,01

0,371±0,030

р1<0,001

0,380±0,041

р1<0,05

МДА, нМ/мл 1 % гемолизата

521,0±33,9

755,0±70,7

р1<0,05

519,4±41,3

р2<0,01

747,3±72,8

р1<0,01

р3<0,01

Примечание.достоверность различий между группами: р1 – по сравнению с контрольной группой, р2 – по сравнению с группой с первичным раком вульвы, р3 – по сравнению с 3 клинической группой.

Было выявлено снижение активности СОД у больных раком вульвы: в группе первичных больных на 15,4 %, у больных 3 клинической группы на 15,3 %, у больных с рецидивом–на18,0 % по сравнению с уровнем в контроле (p<0,05–p<0,001). Активность каталазы, функционирующей в каскаде с СОД, во всех группах обследованных больных достоверно не отличалась от значений в группе здоровых женщин. В отличие от каталазы активность другого перекись устраняющего фермента – ГПО во всех группах больных раком вульвы была достоверно выше, чем в группе доноров: у первичных больных на 51,5 %, у больных 3 клинической группы на 43,4 %, у больных с рецидивом на 49,5 %.

Анализ динамики коэффициентов, характеризующих сбалансированность работы антиоксидантных ферментов эритроцитов, показал, что, несмотря на снижение активности СОД, достоверных изменений значений коэффициента СОД/Каталаза во всех группах больных выявлено не было, что свидетельствует о стабильности в работе каскада ферментов первой линии антиоксидантной защиты. При этом происходило достоверное снижение значения коэффициентов СОД/ГПО и Каталаза/ГПО во всех группах больных по сравнению с уровнем у здоровых женщин: у первичных больных раком вульвы на 56,0 и 50,0 %, соответственно, в 3 клинической группе на 57,2 и 48,9 %, в группе с рецидивом на 46,8 и 47,6 % (за счет повышения активности ГПО), что свидетельствует о несбалансированном функционировании данных ферментов и может привести к активации процессов ПОЛ.

Действительно, было выявлено увеличение содержания МДА (продукта перекисного окисления липидов) в эритроцитах первичных больных и больных с рецидивом рака вульвы: в среднем на 43–45 % по сравнению с уровнем в контроле и по сравнению с уровнем в группе с ремиссией (p<0,05–p<0,01) (табл. 2).

Известно, что основная роль в защите эритроцитов от действия активных форм кислорода как в норме, так и при развитии окислительного стресса, принадлежит ферментам первой линии антиоксидантной защиты, снижение активности которых, на фоне усиления работы ГПО, может служить показателем низкой резистентности эритроцитарных мембран к переокислению. При исследовании состояния мембран эритроцитов у больных раком вульвы было обнаружено увеличение их текучести по сравнению с уровнем у доноров (табл. 3). У больных первичным раком вульвы отмечено увеличение текучести мембран в липидном бислое на 19,7 % по сравнению с контрольной группой (p<0,05). У больных с первичным процессом текучесть мембран эритроцитов увеличивалась не только в липидном бислое, но и в зоне белок-липидных контактов на 17,9 и 18,0 %, соответственно (p<0,05). В группе больных с рецидивом увеличение данного показателя было максимально выраженным среди всех больных раком вульвы: увеличение составило 22,2 и 30,2 %, соответственно, в зоне белок-липидных контактов и в липидном бислое (p<0,05–p<0,01).

Таблица 3

Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов крови больных раком вульвы, у.е. опт.плотности

Группа

Текучесть мембран эритроцитов

Полярность

Погруженность

Белок-липидные контакты

Липидный бислой

Контрольная группа

n=30

0,442±0,024

0,305±0,017

1,423±0,014

0,198±0,008

Первичный рак вульвы

n=30

0,521±0,028

0,1>р1>0,05

0,365±0,013

р1<0,05

1,454±0,012

0,227±0,014

р1<0,05

3 клиническая группа

n=20

0,497±0,022

0,360±0,016р1<0,05

1,456±0,014

0,194±0,018

р2<0,05

Рецидив

n=21

0,540±0,031р1<0,05

0,397±0,026р1<0,01

1,483±0,017р1<0,05

0,232±0,015

р1<0,05

р3<0,05

Примечание.достоверность различий между группами: р1 – по сравнению с контрольной группой, р2 – по сравнению с группой с первичным раком вульвы, р3 – по сравнению с 3 клинической группой.

Надо отметить, что кроме текучести мембран эритроцитов, постепенно нарастала их полярность, достигая у больных с рецидивом рака вульвы хоть и незначительного, но достоверного увеличения на 4,2 % (p<0,05).

Отмечено достоверное изменение показателя погруженности белков в липидный матрикс мембран: у больных первичным раком вульвы данный показатель был достоверно выше значений у здоровых женщин на 14,6 %, (p<0,05), у больных 3 клинической группы не отличался от нормы, а у больных с рецидивом отмечалось возрастание погруженности белков на 17,2 % по сравнению с уровнем контрольной группы и на 19,6 % по сравнению со значениями в 3 клинической группе (p<0,05).

Известно, что текучесть характеризует способность мембран реагировать на происходящие в организме нарушения, в том числе и на развитие злокачественного процесса. Причиной увеличения текучести липидного бислоя может стать усиление процессов свободнорадикального окисления липидов мембран, их взаимодействие с продуктами ПОЛ, изменение липидного состава мембран. Поскольку липиды мембран формируют среду для функционирования мембранных белков, то нарушение структуры липидного бислоя приводит к нарушению конформации связанных с ним белков, повышению их агрегации или фрагментации, что способствует увеличению текучести в зоне белок-липидных контактов, погруженности белков в липидный матрикс и, как следствие, снижению их функциональных возможностей, в том числе рецепторного аппарата [9].

При индивидуальном анализе погруженности белков в липидный матрикс в эритроцитах крови больных 3 клинической группы, находившихся на клиническом наблюдении, выяснилось, что увеличение данного показателя по сравнению со значением в предыдущей точке мониторинга предшествует клиническому проявлению рецидива рака вульвы.

Заключение

Таким образом, сравнительное исследование свободнорадикальных окислительных процессов в крови больных раком вульвы показало, что при достижении длительной ремиссии происходит снижение интенсивности свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, восстановление структурно-функционального состояния мембран эритроцитов.

При рецидивировании рака вульвы происходят нарушения метаболизма, подобные тем, что наблюдаются при первичном процессе. Отмечается усиление интенсивности генерации свободных радикалов в плазме крови, несбалансированность в работе антиоксидантных ферментов, что проявляется повышением активности каталазы и увеличением содержания церулоплазмина в плазме, снижением активности супероксиддисмутазы и существенным усилением активности глутатионпероксидазы в эритроцитах. Однако это не приводит к компенсации процессов липопероксидации, о чем свидетельствует значительное увеличение содержания продуктов перекисного окисления липидов, нарушения структурно-функционального состояния мембран эритроцитов.


Библиографическая ссылка

Неродо Г.А., Горошинская И.А., Иванова В.А., Сурикова Е.И., Качесова П.А., Шалашная Е.В., Неродо Е.А., Немашкалова Л.А., Леонова А.В. ИССЛЕДОВАНИЕ СОСТОЯНИЯ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ВУЛЬВЫ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2014. – № 8-3. – С. 62-66;
URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=5749 (дата обращения: 21.08.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252