Научный журнал

Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Лыков А.П. 1 Кабаков А.В. 1 Райтер Т.В. 1 Бондаренко Н.А. 1 Повещенко О.В. 1 Казаков О.В. 1 Повещенко А.Ф. 1 Стрункин Д.Н. 2 Колмыков С.К. 1 Чанышев М.Д. 3 Гуляева Л.Ф. 3 Коненков И.В. 1

---

1 НИИКЭЛ

2 НИИФКИ

3 ФГБУ НИИ МББ СО РАМН

В патогенезе заболеваний, в том числе и рака, изменениям уровней экспрессия микроРНК отводится существенная роль. Целью исследования стало изучение уровней микроРНК в лимфе при экспериментальном раке молочной железы и взаимосвязи с количеством и функциональной активностью клеток гемо- и лимфопоэза. РМЖ индуцировали введением n-метил-N-нитрозомочевины у крыс линии Wistar. В лимфе исследовали содержание микроРНК-21, 221, 222 и 429. Показано, что между уровнями экспрессии тканями опухоли молочной железы микроРНК, количеством и функциональной активностью клеток гемо- и лимфопоэза сопряженность. Уровни микроРНК при раке молочной железы зависят от вида лечения и сопряжены с параметрами клеток гемо- и лимфопоэза.

Статья в формате PDF

859 KB

рак молочной железы

микроРНК

лимфа

1. Bandopadhyay M., Banerjee A., Sarkar N. et al. Tumor suppressor micro RNA miR-145 and onco micro RNAs miR-21 and miR-222 expressions are differentially modulated by Hepatitis B virus X protein in malignant hepatocytes // BMC Cancer. – 2014. – Vol. 14. – P. 721-733.

2. Hui C., Yujie F., Lijia Y. et al. MicroRNA-34a and microRNA-21 play roles in the chemopreventive effects of 3,6-dihydroxyflavone on 1-methyl-1-nitrosourea-induced breast carcinogenesis // Breast Cancer Research. – 2012. – Vol. 14. – P. 80-91.

3. Jin L.H., Wei C. Role of microRNAs in the Warburg effect and mitochondrial metabolism in cancer // Asian Pac. J. Cancer Prev. – 2014. – Vol. 15. – P. 7015-7019.

4. Juhasz K., Gombos K., Gocze K. et al. Effect of N-methyl-N-nitrosurea on microRNA expression in CBA/CA mice // J. Environ. Occup. Sci. – 2012. – Vol. 1. – P. 77-82.

5. Li Z., Branham W.S., Dial S.L. et al. Genomic analysis of microRNA time-course expression in liver of mice treated with genotoxic carcinogen N-ethyl-N-nitrosourea // BMC Genomics. – 2010. – Vol. 11. – P. 609- 622.

6. Raychaudhuri M., Schuster T., Buchner T. et al. Intratumoral heterogeneity of microRNA expression in breast cancer //J. Mol. Diagn. – 2012. – Vol. q4. – P. 376-384.

7. Shah M.Y., Calin G.A. MicroRNAs miR-221 and miR-222: a new level of regulation in aggressive breast cancer // Genome Medicine. – 2011. – Vol. 3. – P. 56-59.

8. Waters P.S., McDermott A.M., Wall D. et al. (2012) Relationship between Circulating and Tissue microRNAs in a Murine Model of Breast Cancer // PLoS ONE. – 2012. – Vol. 7: e50459. doi:10.1371/journal.pone.0050459.

МикроРНК, группа малых некодируемых РНК в 18-25 нуклеотид, функционирующих в клетках эукариотов как посттранскрипционные регуляторы генов [1-2, 6-8]. Анализ экспрессии микроРНК подтвердил, как проонкогенную, так и опухоль-супрессирующую роль данных молекул. Определение уровней циркулирующей и тканевой микроРНК, может стать основой для ранней диагностики онкологических заболеваний [8]. Показано, что микроРНК вовлечены в патогенез рака молочной железы. Так, в частности при раке молочной железы отмечено повышение уровней экспрессии в тканях молочной железы микроРНК-21, микроРНК-155 и микроРНК-206 [8]. Также микроРНК опосредуют стресс индуцированный ответ [3-5]. Понятие механизмов вовлеченных в канцерогенез при раке молочной железы важно для разработки более эффективной профилактики опухолей и терапии. Известно, что препараты нуклеиновых кислот, применяемые в терапии пациентов с онкологической патологией, способствуют активации, как факторов неспецифической защиты организма, так и факторов специфической защиты организма. Однако эффект экзогенной ДНК на экспрессию микроРНК не исследовался. Поэтому целью исследования стало изучение уровней микроРНК в лимфе при экспериментальном раке молочной железы, с учетом вида проводимого лечения и выявление взаимосвязей с параметрами количества и функциональной активности клеток гемо- и лимфопоэза.

Материалы и методы исследования

Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с соблюдением принципов Хельсинской декларации BMA (2000). Эксперименты выполнены на 67 неполовозрелых крысах-самках линии Wistar. Животные содержались на стандартной лабораторной диете и имели свободный доступ к воде. У 57 крысы РМЖ индуцировали N-метил-N-нитрозомочевиной (30 мг/кг, Sigma-Aldrich, США), а 10 особей составили группу контроля – интактные. Через 6 месяцев у 33 крыс оперативно удалили опухоль молочной железы и далее 9 особей получили ПХТ, 12 особям дополнительно к ПХТ подключили лечение фрагментированной ДНК, 12 особей не получали адъювантной терапии и составили группу контроля оперативного способа лечения РМЖ. Кроме этого, была группа особей, получавшая только ПХТ (n=12) и группа особей, которой не проводилось никакого лечения (n=12). Курс ПХТ включал 5-фторурацил (Ebewe, Австрия в дозе 15 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии), метотрексат (Ebewe, Австрия в дозе 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии) и циклофосфан (ОАО «Биохимия», Саранск в дозе 3 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно однократно 14 дней). Курс терапии фрагментированной ДНК (5мг/кг) проводили внутрибрюшинным введением однократно в течение 14 дней через 3 часа после введения циклофосфана. В экспериментах использовали субстанцию препарата Панаген с содержанием фрагментированной ДНК 1,7 мг/мл. Препарат Панаген (ЛСР № 004429/08 от 09.06.08) представляет собой фрагментированный нуклеопротеидный комплекс, выделенный из плаценты человека. Животных из эксперимента выводили через 6,5 месяцев под наркозом (40 мг/кг нембутана внутрибрюшинно; Sigma-Aldrich, США), что обусловливалась необходимостью прижизненного сбора лимфы из грудного лимфатического протока. Ядросодержащие клетки костного мозга (КМ) получали при помощи перфузии бедренных костей лабораторных животных. Ядросодержащие клетки КМ ресуспендировали в среде DMEM (Биолот, СПб) и пропускали через фильтр (размер пор 80 мкм) для удаления клеточного дебриса, подсчитывали количество жизнеспособных клеток. Для получения костномозговых – мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (КМ-ММСК) ядросодержащие клетки КМ инкубировали в пластиковых флаконах (TPP, Швейцария) в среде DMEM (Биолот, СПб), дополненной 100 мкг/мл гентамицина сульфата (Дальхимфарм, Хабаровск), 2 мM L-глютамина (ICN, США) и 15 % FCS при 37°С в атмосфере 5 % СО2. Через 48 часов неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а прилипающую фракцию клеток культивировали до получения конфлюэнтного слоя. Снятие КМ-ММСК при пассировании осуществляли с использованием 0,25 % раствора трипсина/0,02 % раствора ЭДТА (ICN, США). Суспензию спленоцитов получали измельчением селезенок от лабораторных животных. Мононуклеарные клетки (МНК) из лимфы получали осаждением при 1500 об/мин в течение 5 минут с последующей 2-х кратной отмывкой в забуференном физиологическом растворе. Через 72 часа надосадочная жидкость от клеток КМ, спленоцитов и МНК снималась, разливалась по аликвотам и хранилась при -70°С до момента использования в работе. В кондиционной среде определяли содержание IL-1β, TNF-α, TGF-β1 с использованием коммерческих наборов для иммуноферментного анализа (eBioscience, Австрия). Выделение суммарной РНК из лимфы проводили с использованием набора Qiagen (Rneasy® Lipid Tissue Mini Kit (50), Германия) согласно инструкции. Была проведена ДНКазная обработка образцов при помощи набора RNAse-Free DNAse Set (50) (Qiagen®, Германия) согласно инструкции, после чего образцы последовательно промывали buffer RW1 и buffer RPE. РНК была выделена с колонки 30 мкл RNAse-free water при центрифугировании (1 мин., 8g). Для определения количества выделенной суммарной РНК из лимфы измеряли оптическую плотность раствора (D) на спектрофотометре Agilent 8453 UV-visible Spectroscopy System (Германия) при длинах волн 260, 230 и 280 нм (о степени чистоты РНК от белков судили по величине отношения D260/D280). Приемлемой степенью очистки считали D260/D280=1,6-1,8. О количестве примесей полисахаридов судили по величине отношения D260/D230. Приемлемой степенью очистки считали D260/D230=1,8. Концентрацию РНК в образце рассчитывали, исходя из значения оптической плотности раствора, измеренной при 260 нм. Оптическая плотность, равная 1, соответствует около 40 мкг РНК. Концентрацию РНК рассчитывали по формуле: С (мкг/мл) = [D260 х 40 мкг/мл x Vкюветы (мл)]/ VРНК (мг). Обратную транскрипцию проводили для получения кДНК по матрице микроРНК, выделенной из образцов тканей. Использовали набор реагентов, полученный от компании ЗАО «Вектор-бест» согласно рекомендациям производителя с модификациями. Для каждого образца микроРНК был приготовлен раствор объемом 30 мкл, содержащий 3 мкл микроРНК, 16,2 мкл трегалозы, 3 мкл буфера для ревертирования, 3 мкл раствора dNTP, 3 мкл раствора BSA, 0,32 мкл RT, 1,5 мкл раствора соответствующего праймера к микроРНК. Использовали следующие праймеры:

U6 (малая РНК): 5’-TCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCCATGC-3’;

miRNA 21: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAACATC-3’;

miRNA 221: 5’-TCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAAACCCA-3’;

miRNA 222: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCAGTA-3’;

miRNA 429: 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACGGCATT-3’.

Раствор последовательно инкубировали 5 мин. на 25°С, 30 мин. на 42°С, 2 мин. на 85°С, после чего полученные образцы кДНК были убраны в –20°С. Продукты реакции обратной транскрипции использовали для ОТ-ПЦР. Для определения уровня экспрессии микроРНК miR-21, -221, -222, -429 в лимфе проводили ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием реагентов, полученных от компании ЗАО «Вектор-бест», согласно рекомендациям производителя с модификациями на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве гена сравнения использовали малую РНК U6, которая стабильно экспрессируется в тканях животных. Использовали следующие олигонуклеотидные пробы: U6 (малая РНК) Прямой 5’-GCCGCATACA GAGAAGATTA-3’ Обратный 5’-AGTGCAGGGTC CGAGGTA-3’ Зонд 5’-(R6G)-TTCGCACTGG ATACGACGGCCATGC-(BHQ1)-3’; miR-21 Прямой 5’-GCCGCTAGCTTATCAGACT-3’ Обратный 5’- AGTGCAGGGTCCGAGGTA -3’ Зонд 5’-(R6G)-TTCGCACTGGATACGACTCAACATC (BHQ1)-3’; miR-221 Прямой 5’-GCCGCAG CTACATTGTCTGC-3’ Обратный 5’-AGT GCAGGGTCCGAGGTA-3’ Зонд 5’-(R6G)-T TCGCACTGGATACGACGAAACCCA-(BHQ1)-3’; miR-222 Прямой 5’-GCCGCAG CTACATCTGGC-3’ Обратный 5’-AGTGCAG GGTCCGAGGTA-3’ Зонд 5’-(R6G)-TTCGCA CTGGATACGACACCCAGTA-(BHQ1)-3’; miR-429 Прямой 5’-ACT GCCACTAATACTGTCTGGT-3’ Обратный 5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTA-3’ Зонд 5’-(R6G)-TTCGCACTGGATACGACACGGCATT-(BHQ1)-3’.

Объем реакционной смеси для каждой реакции составлял 30 мкл, в него входили: 3 мкл полученной кДНК, 14 мкл mQ-H2O, 3 мкл буфера для ПЦР, 3 мкл раствора dNTP, 3 мкл раствора BSA, 1 мкл Taq-полимеразы, 3 мкл раствора соответствующего праймера, соединенного с флуорофором (HEX), 0,17 мкл урацил-ДНК-гликозилазы. Протокол реакции ПЦР: предварительный прогрев при 95°С – 3 мин., после этого следовали 50 основных циклов: денатурация при 95°С – 15 с, отжиг при 58°С – 20 с, элонгация и сбор данных по флуоресценции при 72°С – 30 с. Для контроля специфичности ПЦР использовали кривые плавления. Относительный уровень экспрессии генов оценивали с использованием значений пороговых циклов Сt с учетом эффективностей реакций (Е) исследуемого гена и гена «домашнего хозяйства». Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квартилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна-Уитни, и принималась при значениях p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Как видно из табл. 1, в лимфе грудного протока крыс линии Wistar выявлены различные уровни исследуемых микроРНК. Так, отмечено статистически значимое увеличение уровней микроРНК-21 в лимфе при РМЖ в сравнении с интактными особями. Кроме этого, выявлено статистически значимое снижение уровней микроРНК-21 в лимфе крыс линии Wistar, получивших ПХТ без оперативного вмешательства и в группе крыс, получивших сочетание ПХТ с дополнительным введением фрагментированной ДНК после хирургического удаления опухоли молочной железы по сравнению с контрольной группой крыс по РМЖ. В отношении уровней микроРНК-221 в лимфе грудного протока нами не выявлено статистически значимых различий между группами крыс. Установлено статистически значимое снижение уровней микроРНК-222 в лимфе грудного протока у крыс, получивших ПХТ в любых вариациях в сравнении с интактными животными. Также, отмечено статистически значимое снижение уровней микроРНК-222 в лимфе особей, получивших ПХТ в любых вариациях и в группе крыс, получившей только хирургическое лечение по сравнению с контрольной группой по РМЖ. В лимфе крыс, получивших ПХТ после удаления опухоли молочной железы, выявлено статистически значимое снижение уровней микроРНК-222 в сравнении с крысами, получившими хирургическое лечение. Что же касается уровней микроРНК-429 в лимфе грудного протока, то было установлено статистически значимое увеличение уровней в группе крыс, получивших сочетание хирургического и терапевтического вида лечения дополненного введением экзогенной ДНК в сравнении с интактными особями. Кроме этого, данная группа крыс имела статистически значимо большие уровни микроРНК-429 в лимфе по сравнению с контрольной группой по РМЖ и группой крыс, получивших только ПХТ.

Также в группе крыс, получивших только ПХТ уровни микроРНК-429 в лимфе, были статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой крыс по РМЖ.

Как видно из табл. 2, статистически значимых различий по количеству МНК в лимфе между группами не выявлено, что указывает на тот факт, что прошло достаточное время для восстановления пула циркулирующих лимфоцитов. В тоже время, выявлены статистически значимые различия по количеству спленоцитов, ядросодержащих клеток КМ и КМ-ММСК в исследуемых группах животных. Так, отмечено статистически значимое увеличение количества спленоцитов в группе животных, подвергшихся только оперативному лечению, в группе животных, получавших только ПХТ и комбинацию ПХТ с введением фрагментированной ДНК по сравнению с контрольной группой животных, и группой сравнения по РМЖ.

Таблица 1

Уровни микроРНК в лимфе крыс линии Wistar при раке молочной железы (Me, Lq-Hq)

Примечание. * - достоверность различий p < 0,05.

Таблица 2

Окончание табл. 2

Однако в группе животных, подвергшихся оперативному вмешательству с проведением ПХТ, отмечено статистически значимое снижение количества спленоцитов в сравнении с остальными группами животных. Что касается количества клеток КМ, то выявлено статистически значимое снижение их количества во всех экспериментальных группах животных с РМЖ по сравнению с интактными животными. В тоже время, наиболее выраженное подавление количества клеток в КМ отмечено в группе животных, подвергшихся оперативному вмешательству и получавших ПХТ в комбинации с фрагментированной ДНК, в группе животных, получавших только ПХТ и в контрольной группе животных по РМЖ. По количеству КМ-ММСК в исследуемых группах также выявлены статистически значимые различия. Так, выявлен парадоксальный факт статистически значимого увеличения количества КМ-ММСК в группе животных с РМЖ, подвергшихся только оперативному вмешательству по сравнению с остальными группами животных. Не выявлено статистически значимого различия по количеству КМ-ММСК между интактными животными и группой, получавшей терапию фрагментированной ДНК. Количество КМ-ММСК в группах, подвергшихся ПХТ без оперативного вмешательства или же с оперативным вмешательством, а также в контрольной группе по РМЖ, было статистически значимо меньшим по сравнению с интактными животными и группой крыс, получавших терапию фрагментированной ДНК.

Таким образом, с учетом времени прошедшего после проведения различных схем лечения животных с РМЖ, показана различная регенеративная способность органов кроветворения и лимфопоэза.

В отношении пролиферативного потенциала МНК отмечено статистически значимое увеличение в группах особей получивших дополнительное лечение экзогенной ДНК и в группе контроля по РМЖ по сравнению с интактными особями (таблица 2). Интенсивность пролиферативного потенциала МНК в ответ на митогенный стимул была сопоставимой во всех группах, за исключением группы, подвергшейся оперативному вмешательству и дополненной ПХТ. Анализ пролиферативной активности клеток КМ в группах животных с РМЖ выявил статистически значимые различия, как в спонтанном, так и митоген-стимулированном тесте (таблица 2). Так, наивысшая спонтанная пролиферативная активность отмечена в группе крыс, подвергшихся только оперативному вмешательству и в группе опухоленосителей. В остальных экспериментальных группах спонтанный пролиферативный потенциал клеток КМ был статистически значимо ниже по сравнению с интактными животными. Аналогичная картина наблюдается и для пролиферативной активности клеток КМ при стимуляции митогеном. Клетки КМ крыс из группы, подвергшейся только удалению молочной железы, имели статистически значимо высокую пролиферацию в ответ на дополнительную стимуляцию их Конканавалином А. В тоже время, в остальных экспериментальных группах пролиферативный потенциал клеток КМ был статистически значимо меньшим по сравнению с аналогичным показателем для интактных животных. Как видно из таблицы 2, спонтанная пролиферативная активность спленоцитов животных из опытных групп была статистически значимо выше по сравнению с аналогичным параметром в интактной группе. Уровень спонтанной пролиферации в группе, получавшей лечение экзогенной ДНК, был статистически значимо меньшим по сравнению с другими опытными группами, особенно с группой опухоленосителей. Аналогичная картина характерна и для пролиферативной активности спленоцитов, индуцированной митогенным стимулом.

Таким образом, анализ функциональной активности клеток гемо- и лимфопоэза по данным пролиферативного потенциала, как в спонтанном, так и митоген-стимулированном тесте выявил, что не во всех случаях терапия животных фрагментированной ДНК способствовала активации пролиферации клеток гемо- и лимфопоэза.

Нами не выявлено статистически значимых различий по уровню спонтанной продукции TNF-α МНК в исследуемых группах животных (таблица 2). В тоже время, показано статистически значимое увеличение продукции TNF-α при стимуляции МНК митогеном в контрольной группе РМЖ по сравнению с группой животных, подвергшихся оперативному вмешательству и в группе, получившей дополнительно к оперативному вмешательству ПХТ (p < 0,05). В тоже время, уровни спонтанной и митоген-стимулированной продукции TNF-α клетками КМ в группах животных, получивших только ПХТ или же комбинацию ПХТ с оперативным вмешательством по поводу РМЖ, были статистически значимо меньше, нежели в остальных группах животных (p < 0,05). Что же касается уровней продукции TNF-α спленоцитами, то показано статистически значимое снижение уровней спонтанной продукции TNF-α спленоцитами в группе животных, получивших оперативное вмешательство с ПХТ, а также в группе с дополнительной терапией фрагментированной ДНК (p < 0,05). По уровню митоген-стимулированной продукции TNF-α спленоцитами контрольная группа РМЖ отличалась статистически значимо большими уровнями продукции по сравнению с другими группами животных (p < 0,05).

Как видно из табл. 2, по уровню спонтанной и митоген-стимулированной продукции МНК IL-1β в группе контроля РМЖ отмечено статистически значимое увеличение ее в сравнение с уровнями продукции в группе, подвергшейся оперативному вмешательству, а также в группах получивших ПХТ с экзогенной ДНК или без экзогенной ДНК (p < 0,05). Кроме этого, отмечено статистически значимое увеличение уровней продукции IL-1β при стимуляции МНК митогеном в группе, подвергшейся оперативному вмешательству по сравнению с группой, получившей терапию фрагментированной ДНК (p < 0,05). В группе животных, подвергшихся оперативному вмешательству с последующей ПХТ и лечением фрагментированной ДНК, отмечено статистически значимое уменьшение уровней продукции, как спонтанной, так и митоген-стимулированной, IL-1β по сравнению с другими группами животных (p < 0,05). Что касается уровней продукции IL-1β клетками КМ, то показано, что уровни спонтанной и митоген-стимулированной продукции IL-1β в группах животных, получивших только ПХТ или же комбинацию ПХТ с оперативным вмешательством по поводу РМЖ, были статистически значимо меньше, нежели в остальных группах животных (p < 0,05). Показано статистически значимые меньшие уровни продукции спленоцитами, как спонтанной, так и митоген-стимулированной, IL-1β по сравнению с другими группами животных (p < 0,05) в группе животных, подвергшихся оперативному вмешательству с последующей ПХТ и лечением фрагментированной ДНК.

Как видно из табл. 2, установлено статистически значимое снижение уровней продукции TGF-β1 МНК в группе, получившей только ПХТ по сравнению с группой, подвергшейся оперативному вмешательству с ПХТ, или без ПХТ (p < 0,05). В отношении уровней спонтанной продукции TGF-β1 клетками КМ отмечено статистически значимое снижение уровней продукции в группах, получивших только ПХТ, ПХТ и оперативное вмешательство, а также в контрольной группе РМЖ по сравнению с остальными группами животных (p < 0,05). По уровням продукции TGF-β1 клетками КМ контрольная группа животных по РМЖ и группа, получившая ПХТ после оперативного вмешательства, статистически значимо меньше продуцировали уровни TGF-β1 на митогенный стимул по сравнению с остальными группами животных (p < 0,05). В отношении уровней продукции TGF-β1 спленоцитами установлено, что статистически значимо меньшие уровни спонтанной продукции характерны для группы животных, получившей ПХТ после оперативного вмешательства по сравнению с другими группами животных (p < 0,05). В группах животных, получивших ПХТ, комбинацию оперативного лечения с ПХТ и с фрагментированной ДНК или без фрагментированной ДНК уровни продукции TGF-β1 спленоцитами в ответ на митогенный стимул были статистически значимо меньше, нежели в других группах животных (p < 0,05).

Корреляционный анализ данных между уровнями микроРНК в лимфе и параметрами клеток гемо- и лимфопоэза при РМЖ с учетом вида лечения выявил наличие их взаимосвязи. Так, показана прямая и высокая взаимосвязь уровней микроРНК-21 с количеством спленоцитов в группе особей, получавших ПХТ (r=0,76; p=0,027). Уровни в лимфе микроРНК-221 взаимозависимы с количеством лимфоцитов и спленоцитов в группе особей, получавших хирургическое лечение (r=0,95; p=0,003 и r=0,82; p=0,041 соответственно). Более того, уровни в лимфе микроРНК-221 находились в прямой и высокой степени сопряженности с пролиферативной активностью спленоцитов в группе крыс, получавших хирургическое лечение (r=0,95; p=0,003). Выявлена прямая и высокая взаимосвязь уровней миркоРНК-221 лимфы в группе крыс, получавших хирургическое лечение с уровнями: спонтанной продукции лимфоцитами и спленоцитами TNF-α; с уровнями спонтанной и КонА стимулированной продукции клетками КМ TNF-α и IL-1β: с уровнями спонтанной продукции клетками КМ TGF-β1; с уровнями спонтанной продукции и митоген-стимулированной продукции IL-1β; с уровнями митоген-стимулированной продукции спленоцитами TGF-β1 (r=0,95; p=0,003). В группе крыс контрольной по РМЖ установлена сопряженность между уровнями в лимфе микроРНК-221 с параметрами спонтанной продукции спленоцитами IL-1β (r=0,75; p=0,049). В отношении уровней в лимфе микроРНК-222 в группе крыс контрольной по РМЖ выявлена взаимосвязь ее с уровнями спонтанной продукции клетками КМ TNF-α, IL-1β и TGF-β1, и с уровнями спонтанной продукции спленоцитами IL-1β (r=0,81; p=0,028). В группе крыс, получавших только ПХТ, установлена обратная и сильная сопряженность уровней микроРНК-222 с уровнями спонтанной и митоген-активированной продукции лимфоцитами IL-1β (r=-0,86; p=0,012 и r=-0,82; p=0,01 соответственно), и с уровнями спонтанной продукции TGF-β1 (r=-0,97; p=0,0002). Уровни микроРНК-222 в лимфе в группе крыс, получавших ПХТ, были взаимосвязаны с уровнями спонтанной продукции клетками КМ TNF-α и TGF-β1 (r=0,97; p=0,0002 и r=0,86; p=0,012 соответственно), и с уровнями спонтанной и митоген-стимулированной продукции IL-1β (r=0,86; p=0,012 и r=0,97; p=0,0002 соответственно). Также, у крыс, получавших ПХТ, уровни микроРНК-222 в лимфе были сопряжены: с уровнями спонтанной и митоген-стимулированной продукции спленоцитами TNF-α (r=0,75; p=0,049 и r=0,86; p=0,012 соответственно); с уровнями спонтанной продукции IL-1β (r=0,97; p=0,0002); с уровнями митоген-стимулированной продукции TGF-β1 (r=0,86; p=0,012). Что касается крыс, получавших курс ПХТ после хирургического вмешательства, то было установлена сопряженность уровней микроРНК-222 в лимфе с уровнями спонтанной и митоген-стимулированной продукции клетками КМ IL-1β (r=0,88; p=0,019), и с уровнями спонтанной продукции TGF-β1 (r=0,88; p=0,019). Также, для данной группы животных установлена взаимосвязь уровней микроРНК-222 с уровнями спонтанной продукции спленоцитами IL-1β и TGF-β1 (r=0,88; p=0,019).

Полученные нами данные по изменению уровней микроРНК при экспериментальной модели РМЖ не противоречат литературным данным. В частности, в работе [5] отмечено нарушение экспрессии микроРНК клетками печени. При инициации РМЖ введением НМН в клетках опухоли молочной железы отмечена повышенная экспрессия микроРНК-21 [2]. Что же касается уровней микроРНК в лимфе, то нами не найдено исследований, посвященным изучению уровней микроРНК в лимфе, поэтому мы не можем судить о совпадении или же различий уровней микроРНК в лимфе при экспериментальной модели рака молочной железы у крыс.

Заключение

Уровни микроРНК в лимфе зависели от вида проведенного лечения и были сопряжены с количеством и функциональной активностью клеток гемо- и лимфопоэза, что может быть использовано для прогнозирования эффективности неоадъювантной полихимиотерапии при раке молочной железы.

Библиографическая ссылка