Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,580

ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Зыкова Т.А. 1 Шевченко А.Н. 1 Хомутенко И.А. 1 Панова Н.И. 1 Богомолова О.А. 1 Алавердян И.А. 1 Савочкина Ю.А. 2
1 Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Министерства здравоохранения Российской Федерации
2 ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора
В работе представлены результаты исследований клинического материала (моча, плевральная жидкость, раневое отделяемое, ликвор) при развитии инфекционных осложнений у онкологических больных. Сравнивали эффективность исследований, выполненных с использованием классического культурального и метода ПЦР-РВ. Частота полного совпадения результатов исследований для образцов мочи составила 66,6 %, образцов раневого отделяемого – 58,5 %. В случаях развития ИМП при использовании ПЦР-РВ различные патогены были обнаружены в 2,15 раза чаще, чем при использовании классического культурального метода, а при раневых инфекциях в 2,21 раз чаще. Метод молекулярной детекции показал большую эффективность по сравнению с культуральным, позволил быстрее получить результат и может быть рекомендован в случаях необходимости принятия срочного решения о проведении антибиотикотерапии.
ПЦР-РВ
молекулярная детекция
инфекционные осложнения
методы исследований
1. Аминев Р.А. Билалов Ф.С., Шарафутдинов Н.Х. Организация молекулярной диагностики инфекций мочевыводящих путей // Молекулярная диагностика 2014: сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции, – Москва, 2014. – Т. 1. – С. 261–262.
2. Зыкова Т.А. Богомолова О.А., Панова Н.И., Малейко М.Л., Бут О.А Выявление генов ОХА-карбапенемаз у изолятов Acinetobacter baumannii, выделенных в стационарах Ростова-на-Дону // Молекулярная диагностика 2014: сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции, – Москва, 2014. – Т. 1. – С. 273.
3. Зыкова Т.А., Богомолова О.А. Определение генов резистентности у грамотрицательных бактерий молекулярными методами // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2014. – Т.16, №2, Приложение 1: тезисы XVI Международного конгресса МАКМАХ по антимикробной химиотерапии. – С. 21.
4. Инфекции в онкологии/под ред. М.И. Давыдова, Н.В. Дмитриевой. – М.: Практическая медицина, 2009. – 472с .: ил.
5. Лопухов Л.В., Эйдельштейн М.В. Полимеразная цепная реакция в микробиологической практике // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2000. – Т. 2. – № 3. – С. 96–106.
6. Припутневич Т.В. и др. Использование методов MALDI-TOF масс-спектрометрии и количественной ПЦР для быстрой диагностики септических состояний // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2014. – Т. 16. – № 1. – С. 4–9.
7. Тихомиров Д.С., Туполева Т.А., Шипулина О.Ю., Савочкина Ю.А., Игнатова Н.Е., Галстян Г.М., Филатов Ф.П. Метод амплификации нуклеиновых кислот в диагностике бактериальных осложнений у больных в критическом состоянии // Молекулярная диагностика 2014: сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции, – Москва, 2014. – Т. 1. – С. 290–291.
8. Тихомиров Д.С., Катрыш С.А., Савочкина Ю.А., Гаранжа Т.А., Туполева Т.А., Филатов Ф.П., Галстян Г.М. Мультиплексная ПЦР как новый метод определения генов устойчивости карбапенемам // Гематология и трансфузиология. – 2014. – Т.59. – №1.: материалы II конгресса гематологов России. – С. 123.
9. Zykova T., Bogomolova O., Savochkona Y. Molecular methods in epidemiologic monitoring of hospital microflora. European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Copenhagen, Denmark 25-28 April 2015, P0835.
10. Tatiana A. Zykova, Michail L. Maleyko, Olga A. Bogomolova, Natalia I. Panova, Sergei A. Ilchenko, Vladimir A. Dontsov, Igor V. Goncharov. Frequency of methicillin-resistant staphylococcus aureus carriage state in patient of a cancer hospital. J Clin Oncol 2014 32, 2014 ASCO Annual Meeting, (suppl; abstr е 15086).

Онкологические больные относятся к особой группе риска в отношении развития инфекционных осложнений. Это связано как с дефектами иммунной системы, так и многочисленными инвазивными манипуляциями, длительными госпитализациями, многократными курсами химиолучевой терапии, агрессивной антимикробной терапией [5].

Успешное разрешение проблемы инфекционных осложнений у онкологических больных состоит как в их предупреждении, так и в этиологически оправданном и своевременном лечении. Для назначения этиотропной терапии необходима быстрая и точная идентификация этиологического агента инфекционного осложнения, а это диктует необходимость использования высокочувствительных и высокоспецифичных экспресс-методов диагностики.

Несмотря на широкое внедрение в работу микробиологических лабораторий новых автоматизированных систем для идентификации и определения чувствительности микроорганизмов классические культуральные методы не всегда бывают достаточно чувствительными. К недостаткам классических методов относится их длительность, особенно для медленнорастущих патогенов, невозможность детекции некультивируемых микроорганизмов, влияние антибактериальной терапии на результаты анализа. Этих недостатков лишены молекулярные методы, позволяющие осуществлять прямую идентификацию возбудителя в первичном клиническом материале.

Наиболее распространенными в клинической практике микробиологических исследований являются различные модификации ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [6]. Этот метод давно и успешно применяется в ряде областей лабораторной медицины, в частности для диагностики инфекций, передающихся половым путем, вирусных гепатитов. Однако в широкой практике микробиологических исследований других воспалительных заболеваний, в частности инфекций мочевых путей (ИМП) и раневых инфекций этот метод используется редко. В отдельных публикациях представлены результаты применения ПЦР-РВ для диагностики сепсиса и инфекционных осложнений у больных, находящихся в критическом состоянии [7, 8], ИМП [1]. В свете изложенного сопоставление результатов исследований, полученных с использованием классического культурального и молекулярного метода идентификации микроорганизмов, при развитии инфекционных осложнений у онкологических больных представляет актуальную задачу.

Цель исследования. Сравнительная оценка эффективности ПЦР в реальном времени и классического культурального метода в диагностике инфекционных осложнений у онкологических больных.

Материалы и методы исследования

Исследовано 55 образцов биологического материала, в том числе 33 образцов мочи, 8 образцов плевральной жидкости и 14 образцов отделяемого послеоперационной раны. Один и тот же образец изучали с помощью классического культурального метода и методик, разработанных ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. При использовании культурального метода видовую принадлежность изолированных штаммов и определение чувствительности определяли с помощью автоматической системы VITEK 2 (bioMerieux,Франция).

Экстракцию ДНК из клинического материала проводили с использованием набора реагентов «Рибо-преп» производства ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в соответствии с инструкцией производителя в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО-FL). Предварительно 1 мл образца мочи центрифугировали при 11000g в течение 10 минут, надосадочную жидкость удаляли, к осадку добавляли 300 мкл лизирующего раствора. Далее процедура выделения ДНК соответствовала методике производителя. ДНК из образцов плевральной жидкости и раневого отделяемого выделяли без предварительной обработки.

Для обнаружения ДНК микроорганизмов использовали три методики ЦНИИЭ: «АмплиСенсЭнтеробактерии/G(+) для определения ДНК семейства (Enterobacteriaceae spp.), стафилококков (Staphylococcus spp.), стрептококков (Streptococcus spp.) и энтерококков (Enterococcus spp.), «АмплиСенсG(-)Ab/Kp/Pa/Ec-Fl» для определения ДНК Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и «АмплиСенс®ФлороЦеноз/Кандиды-Fl» для определения ДНК грибов рода Candida: C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis. Все методики основаны на использовании мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени. Для выполнения количественного анализа проводили одновременную амплификацию с детекцией для образцов ДНК, полученных из клинического материала и ДНК-калибраторов. Количество ДНК обнаруженных микроорганизмов в образцах биологического материала рассчитывали в геномных эквивалентах/мл (ГЭ/мл).

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ полученных данных показал, что нестерильными по результатам культурального исследования оказалось 39,4 % образцов мочи, 12,5 % плевральной жидкости и 53,8 % раневого отделяемого.

При исследовании этого же клинического материала методом ПЦР-РВ положительными были 60,6 % образцов мочи, 62,5 % образцов плевральной жидкости и 69,2 % образцов отделяемого операционной раны. Всего при классическом микробиологическом исследовании мочи было изолировано 16 культур микроорганизмов из 13 образцов (39,4 %), в ПЦР выявлена ДНК 28 микроорганизмов в 20 образцах (60,6 %).

При сопоставлении результатов исследования образцов мочи, полученных разными методами, из анализа были исключены образцы с количеством менее 10^3 ГЭ/мл (в ПЦР). Полное совпадение результатов отмечено в 28 случаях (66,6 %). В двух случаях в ПЦР был получен отрицательный результат при положительных результатах посевов (E. faecalis106 КОЕ/мл и E.coli 108 КОЕ/мл). В 12 случаях (28,6 %) при отрицательных результатах посевов в ПЦР был обнаружен генетический материал возбудителей ИМП (табл. 1). Уровень обсемененности при этом составил 103 ГЭ/мл (7 образцов), 104 ГЭ/мл (2 образца), 105 ГЭ/мл (2 образца) и 107 ГЭ/мл (один образец).

Дискордантные результаты, на наш взгляд, можно объяснить как большей чувствительность метода, так и возможностью определения ДНК погибших микроорганизмов, т.к. многие пациенты на момент обследования получали антибактериальные препараты.

В этиологической структуре ИМП у онкологических больных при поступлении в стационар преобладали традиционные уропатогены: E.coli, Enterococcus spp., Kl.pneumoniae (табл. 2). Однако ранговые значения различных патогенов при исследовании культуральным и молекулярным методом отличались. Так, при исследовании классическим методом чаще других была обнаружена Kl.pneumoniae, затем Enterococcus spp. и E.coli. При исследовании методом ПЦР-РВ чаще других была обнаружена ДНК E.coli, реже Kl.pneumoniae и Enterococcus spp. Моноинфекция была обнаружена в 10 случаях (76,9 % от положительных образцов) при исследовании культуральным методом и в 12 случаях (60,0 %) при исследовании методом ПЦР. Помимо рассмотренных случаев в двух образцах была обнаружена ДНК Ps.aeruginosa и в одном образце A.baumannii с уровнем обсемененности 102ГЭ/мл. Ps.aeruginosa, A.baumannii, Streptоcoccus spp. и грибы рода Candida были обнаружены только при использовании метода ПЦР.

В связи с этим на наш взгляд, в случае широкого использования ПЦР в рутинной практике необходимо продумать вопрос о правомочности автоматического переноса критериев интерпретации клинической значимости результатов, полученных с использованием культурального метода на метод молекулярный. В рассматриваемых случаях пациентам предстояло оперативное вмешательство на мочевом пузыре с трансуретральным доступом. И может быть, с учетом характера предстоящего вмешательства, целесообразно установить более тщательное наблюдение или дополнительное обследование пациентов с низким содержанием ДНК клинически значимых микроорганизмов в образцах мочи для своевременного выявления и адекватной терапии ранних послеоперационных осложнений.

Всего при классическом микробиологическом исследовании отделяемого послеоперационной раны и плевральный жидкости было изолировано 14 культур микроорганизмов в 8 образцах, в ПЦР обнаружена ДНК 31 микроорганизма в 13 образцах.

Полное совпадение результатов отмечено в 58,5 % случаев (табл. 3). В 41,5 % случаев генетический материал различных микроорганизмов был обнаружен в ПЦР и не обнаружен при посеве. При этом только в 7 образцах (41,2 %) количество ДНК было в пределах 104-107 ГЭ/мл, в 10 (58,8 %) случаях ДНК возбудителей бактериальных инфекций была обнаружена в количестве 103 ГЭ/мл.

В этиологической структуре возбудителей инфекционных осложнений при исследовании классическим культуральным методом преобладали Enterococcus spp., Ps. aeruginosa, E. coli и A.baumannii (табл. 4). При исследовании методом ПЦР-РВ чаще других была обнаружена ДНК E. coli, далее по мере уменьшения Enterococcus spp., Staphylococcus spp. и Ps. aeruginosa. Streptococcus spp. и грибы рода Candida были обнаружены толь методом ПЦР.

Таблица 1

Результаты параллельных исследований образцов мочи культуральным и молекулярным методом

Количество проб/

микроорганизмов (абс)

Количество проб/

микроорганизмов ( %)

Отрицательные в ПЦР и при посеве (образцы)

14

33.3

Положительные в ПЦР и при посеве

(выявленные микроорганизмы)

14

33.3

Отрицательные в ПЦР и положительные при посеве (выявленные микроорганизмы)

2

4.8

Положительные в ПЦР и отрицательные при посеве (выявленные микроорганизмы)

12

28.6

Всего

42

100.0

Таблица 2

Структура возбудителей ИМП у онкологических больных при исследовании культуральным и молекулярным методом

Микроорганизмы

По результатам

посева

По результатам ПЦР

Абс.

%

Абс.

%

Kl. pneumoniae

6

37,5

7

25,0

E. faecalis (Enterococcus spp.*)

5

31,25

6

21,4

E. coli

4

25,0

8

28,6

S. epidermidis (Staphylococcus spp.*)

1

6,25

2

7,1

Streptococcus spp.*

3

10,7

C. glabrata

2

7,1

Всего культур

16

100,0

28

100,0

Примечание. *ПЦР.

Таблица 3

Результаты параллельных исследований образцов раневого отделяемого и плевральной жидкости культуральным и молекулярным методом

Количество проб/

микроорганизмов (абс)

Количество проб/

микроорганизмов ( %)

Отрицательные в ПЦР и при посеве (образцы)

10

24.4

Положительные в ПЦР и при посеве (выявленные микроорганизмы)

14

34.1

Положительные в ПЦР и отрицательные при посеве (выявленные микроорганизмы)

17

41.5

Всего

41

100.0

Таблица 4

Структура возбудителей инфекционных осложнений у онкологических больных при исследовании культуральным и молекулярным методом

Микроорганизмы

По результатам

посева

По результатам ПЦР

Абс.

%

Абс.

%

E. faecalis (Enterococcus spp.*)

4

28.6

7

22.6

Ps. aeruginosa

4

28.6

4

12.9

E. coli

3

21.4

9

29.0

A.baumannii

2

14.3

3

9.7

S.epidermidis (Staphylococcus spp.*)

1

7.1

6

19.4

Streptococcus spp.*

-

-

1

3.2

C. glabrata

-

-

1

3.2

Всего культур

14

100.0

31

100.0

Примечание. *ПЦР.

Результаты исследований показали, что молекулярный метод детекции оказался более эффективным, чем классический культуральный. В случаях развития ИМП при использовании ПЦР-РВ различные патогены в клинически значимом количестве были обнаружены в 2,15 раза чаще (28 патогенов против 13), чем при использовании классического культурального метода, а при раневых инфекциях в 2,21 раз чаще (31 патоген против 14).

К недостаткам молекулярного метода относится возможность детекции только определенных, наиболее распространенных возбудителей бактериальных инфекций. В этом случае перед исследователем каждый раз стоит вопрос выбора определяемых патогенов в зависимости от задачи исследования и вида клинического материала (моча, ликвор, кровь, отделяемое раны). В условиях большого потока клинического материала трудно будет унифицировать подобные исследования. Другим недостатком молекулярного метода является невозможность определения чувствительности к конкретным антимикробным препаратам. Однако на отечественном рынке реагентов для in vitro диагностики уже доступны наборы для определения генов карбапенемаз и β-лактамаз. Ряд исследователей сообщали об опыте использования этих наборов [9]. Результаты изучения распространения генов резистентности у представителей семейства Enterobacteriaceae, A.baumannii, MRSA в онкологическом стационаре были также опубликованы нами ранее [3, 4, 10, 11].

Использование молекулярной детекции для этиологической диагностики ИМП и раневых инфекций значительно сокращает время анализа, что, в свою очередь, позволяет клиницистам принимать своевременные и обоснованные решения по терапии инфекционных осложнений у иммунокомпроментированных пациентов.

Классические микробиологические и молекулярные методы идентификации возбудителей инфекционных заболеваний не являются взаимозаменяемыми, но лишь дополняют друг друга. Учитывая скорость развития инфекционного процесса у онкологических больных исследования, проведенные с привлечением молекулярных методов, на наш взгляд, могут служить эффективным инструментом для своевременного выявления проблемных микроорганизмов, в том числе штаммов, несущих генетические детерминанты резистентности.

Выводы

Молекулярные методы являются более эффективными, позволяют быстро получить результат и могут быть рекомендованы в случаях необходимости принятия срочного решения о проведении или коррекции антибиотикотерапии с учетом данных локального микробиологического мониторинга.


Библиографическая ссылка

Зыкова Т.А., Шевченко А.Н., Хомутенко И.А., Панова Н.И., Богомолова О.А., Алавердян И.А., Савочкина Ю.А. ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 10-5. – С. 840-844;
URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=7640 (дата обращения: 25.06.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074