Прогрессирование специфического туберкулезного процесса происходит на фоне снижения функциональных возможностей фагоцитирующих клеток на фоне повышенного образования в организме активных форм кислорода (АФК) и снижении антиоксидантных механизмов защиты [3, 7, 10]. Накапливается все больше данных о том, что большое значение в механизмах защиты и повреждения при туберкулезном процессе могут иметь высокоактивные соединения азота (ВСА) [3, 7, 8]. Однако окончательной ясности о роли этих биологически активных молекул в механизмах защиты и повреждения при туберкулезе нет. Лейкоциты крови принимают активное участие в генерации АФК и ВСА [3, 7]. В последние годы появляется все больше сообщений о том, что именно лейкоциты крови могут играть существенную роль в неспецифической резистентности к МБТ [3, 7]. Вполне вероятно эффект защиты происходит за счет генерации таких агрессивных молекул как АФК и ВСА, но сведений посвященных этим вопросам недостаточно.
Целью настоящего исследования было уточнить значение функционально – метаболических особенностей лейкоцитов крови в механизмах защиты и повреждения у животных с разной степенью устойчивости к туберкулезу после заражения их МБТ.
Материалы и методы исследования
Для проведения эксперимента были взяты устойчивые к МБТ крысы, мыши, и высокочувствительные к МБТ морские свинки.
Исследования проводились на беспородных белых крысах, мышах и морских свинках из питомника Уральского НИИ Фтизиопульмонологии, которые содержались в стандартных условиях вивария согласно принятым требованиям. Всего в исследованиях было 16 морских свинок (10 опытных и 6 контрольных) в возрасте 3–4 месяца массой 250–300 г, 16 крыс (10 опытных и 6 контрольных) в возрасте 3 месяца массой 200–250 гр. и 25 мышей (15 опытных и 10 контрольных) массой 50 гр. План эксперимента был рассмотрен и утвержден биоэтической комиссией УНИИФ.
Для воспроизведения экспериментального туберкулеза использовали музейный штамм микобактерий центрального НИИ туберкулеза Н37Rv (1993 г.). Морские свинки заражались 2-х недельной живой культурой в паховую складку в дозе 0,001 мг, крысы дозой 0,1 мг, мыши дозой 0,1 мг в хвостовую вену. Выведение животных из эксперимента производилось через 6 недель после заражения при развитии у морских свинок генерализованного туберкулеза.
Для определения исследуемых показателей у животных под наркозом забирали кровь из сердца. Для биохимических исследований были заморожены образцы сыворотки крови и лейкоцитарной взвеси. Проводили исследования фагоцитарной активности лейкоцитов крови общепринятыми методами, метаболической активности лейкоцитов в НСТ тесте. При помощи иммуноферментного анализатора в плазме крови и лейкоцитах исследовали уровень суммарных перекисей липидов (по показателям OXYSTATA) и стабильных производных (нитрата) оксида азота, количество свободных аминокислот и глутатиона.определяли при помощи газожидкостной хроматографии.
В плазме крови находили содержание аскорбиновой и дикетогулоновой кислот общепринятыми методами.
В лабораторной части эксперимента использовали следующие методы и диагностические тест-системы:
1. У всех животных были подсчитаны процент фагоцитирующих нейтрофилов, число поглощенных бактерий на 1 мкл, базальный и стимулированный продигиозаном уровни НСТ-теста, коэффициент стимуляции
2. OXYSTAT определяли при помощи набора BiomedicaGRUPPE
3. Производные оксида азота (нитрит) находили по методу RandDSystems,
4. Содержание глутатиона восстановленого и окисленного, а так же свободных аминокислот плазмы крови и лейкоцитов, определяли на газожидкостном анализаторе ААА 339М «Микротехника», при этом перед исследованием на содержание аминокислот плазму крови и лейкоцитарную взвесь депротеинезировали 50 % раствором трихлоруксусной кислоты.
5. Содержание аскарбиновой и дикетогулоновой кислот определяли с использованием парадиметиламинобензальдегида [2].
При обработке полученных данных мы применяли непараметрические методы с использованием программы Excel. Оценка степени достоверности различий между группами оценивалась по критерию «U» Манна–Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение
На момент выведения из эксперимента у всех зараженных морских свинок развивался генерализованный туберкулез с преимущественным поражением селезенки, печени, лимфоузлов, легких. У крыс и мышей не смотря на то, что доза заражения была в 100 раз большей, туберкулезный процесс не развивался.
Установлено, что у животных с различной видовой устойчивостью к МБТ генерация ВСА в организме в ответ на заражение музейным штаммом МБТ-Н37 rv значительно отличается. Так у морских свинок количество конечного продукта окисления ВСА – нитрита в плазме крови возрастает после заражения от 56,0 ± 11,2 в контроле до 88,8 ± 10,5 мкмоль/л, то есть примерно в 1,6 раза( р < 0,01 к контролю), тогда как у крыс достоверного увеличения этого вещества к контролю не наблюдается (26,14 – 31,9 мкмоль/л соответственно). Следует отметить, что морские свинки располагают вообще большими ресурсами ВСА, поскольку в контроле содержание нитрата в плазме у этих животных более чем в 2 раза превосходит таковой у крыс (р < 0,01).
Обращает на себя внимание, что у морских свинок так же гораздо более высокие показатели суммарных перекисей липидов определяемых по оксистату. Их содержание в крови у здоровых морских свинок составляет 394,46 ± 54,8 мкмоль/л., в то время как у зараженных – 609,53 + – 143,40 (р < 0,01). У крыс их содержание 145,4 ± 31,6 – 163,8 ± 18,8 мкмоль/л соответственно, то есть, изменений после заражения практически не наблюдается (р > 0,05). Разница между морскими свинками и крысами по уровню суммарных перекисей в контрольных группах составляет, примерно, в 2 раза (р < 0,01).
Но после заражения МБТ это различие становится почти 4х кратным. При этом у крыс увеличения показателей оксистата практически не наблюдается, а у морских свинок его уровень резко возрастает (почти в 2 раза – p < 0,01).
Нитрит является конечным метаболитом ВСА генерируемых эндотелием, фагоцитами, а оксистат – показатель конечных метаболитов превращения свободных радикалов кислорода – АФК [4, 6]. Поэтому динамика значений нитрита и оксистатав крови является неким интегральным показателем способности организма генерировать ВСА и АФК. А общее состояние организма животных после заражения отражает его способность оперировать с этими биологически активными и достаточно агрессивными молекулами.
Защитный или повреждающий эффект АФК и ВСА при туберкулезе зависит от состояния антиоксидантной и других защитных систем организма [4,6] и модулируется такими метаболитами как аскорбиновая кислота, глутатион восстановленный или окисленный, таурин, аргинин и рядом других биологически активных веществ синтезируемых в печени и других органах [5, 8, 9]. Было установлено, что в печени крыс после заражения значительно возрастает количество аскорбиновой кислоты (АК) (почти в 3 раза – р < 0,01), а у морских свинок (которые в отличии от крыс не могут ее синтезировать) наблюдается ее более чем 2 кратное уменьшение (р < 0,01) (табл. 1).
Противоположные изменения претерпевают и метаболиты АК. В печени морских свинок увеличивается содержание дикетогулоновой кислоты (ДКГК) (448 мкг/г в контроле до 864 мкг/г после заражения р < 0,05), а у крыс существенных изменений количества этого метаболита не происходит (р > 0,05).
Противоположную направленность имеют изменения количества такого метаболита как глутатион, имеющего тесную взаимосвязь с обменом АК.
У морских свинок в печени после заражения значительно увеличивается количество глутатиона окисленного (Г-SS-Г) (до 1438,8 мкг/г – р < 0,01), который и в контроле был несколько больше, чем у крыс. Надо отметить, что и ресурс глутатиона восстановленного (Г-SH) в печени морских cвинок гораздо выше, чем у крыс (712,5 против 433,2 мкг/г – различие достоверно – р < 0,01) (табл. 2).
Как видим в защитных механизмах к воздействию МБТ у крыс преобладает АК и усиливается ее биосинтез, тогда как у морских свинок после заражения МБТ содержание АК резко уменьшается, но увеличивается ее метаболит ДКГК, который может включаться в метаболические процессы необходимые для поддержания глутатиона в восстановленном состоянии (пентозный цикл) [7, 8]. При этом общее количество глутатиона у морских свинок резко возрастает и он интенсивно окисляется. АК и глутатион мощные антиоксиданты и биологические молекулы, выполняющие важнейшую защитно-адаптивную функцию на метаболическом уровне. В том числе, и по отношению к туберкулезной инфекции [3, 5, 7, 8]. Как видим, преобладание АК у крыс на этом уровне связано с их высокой устойчивостью к МБТ, а преобладание глутатионовой системы у морских свинок делает их абсолютно беззащитными к туберкулезу.
При этом установлено, что помимо АК в высокой устойчивости крыс к МБТ может иметь отношение такой метаболит как таурин, являющийся антиоксидантом, стабилизатором мембран и стимулятором фагоцитарных реакций организма [5, 9]. Среди всех свободных аминокислот тканей крыс таурин составляет до 50 % и более [5], а у морских свинок таурина в тканях на порядок, а то и на 2 меньше, чем у крыс. Так, например, в костном мозге крыс содержание таурина составляет 5859,1 ± 620,4 а у морских свинок 468,7 ± 71,1 мкг/г, почти столь же значительны отличия и по содержанию глутатиона восстановленного в костном мозге (Г-SH) 1199,4 ± 142,5 против – 422,9 ± 67,1 мкг/г (во всех случаях р < 0,01).
Таблица 1
Содержание аскорбиновой кислоты в печени морских свинок и крыс после заражения МБТ(в мкг/г)
|
Группы животных (количество в группе) |
Контроль (интактные n = 6) |
Заражение МБТ n = 10 |
|
Морские свинки |
142,4 ± 21,5 (83,0–196,7) |
74,2 ± 15,4 (25,3–123,1)* |
|
Крысы |
225,6 + – 42,1(132,4–364,5) |
736,2 + – 56,8(284,6–1376,8)* |
Таблица 2
Содержание глутатиона восстановленного и окисленного в ткани печени морских свинок и крыс после заражения МБТ (в мкг/г сырого веса ткани)
|
Вид животных |
Показатели |
Контроль (интактные n = 6) |
Заражение МБТ (n = 10) |
|
Морские свинки |
Глутатион восстановленный |
712,5 ± 87,5 (462,7–1158,0) |
585,7 ± 59,4 (349,6–822,9) |
|
Глутатион окисленный |
465,9 ± 72,8 (246,8–725,0) |
1438,8 ± 218,1 (869,3–2150,9)** |
|
|
Крысы |
Глутатион восстановленный |
433,2 ± 31,5 (366,1–465,8) |
296,7 ± 58,9 (112,5–420,2) |
|
Глутатион окисленный |
394,6 ± 89,6 (197,5–771,4) |
356,2 ± 96,5 (97,8–577,2) |
Примечание. * Отмечены результаты статистически достоверно отличающиеся от контроля (р < 0,05); ** – р < 0,01.
Таблица 3
Оценка фагоцитарной способности нейтрофилов у морских свинок, крыс и мышей зараженных МБТ
|
Вид животных |
Показатели фагоцитоза |
Зараженные МБТ (n = 10) |
Интактные (контроль) (n = 6) |
|
Морские свинки |
Средний процент фагоцитирующих нейтрофилов |
73,6* (65,4–82,5) |
81,75(76,1–87,0) |
|
Среднее число поглощенных бактерий на 1 мкл |
6,8* (4,9–9,9) |
9,4 (7,2–11,1) |
|
|
Крысы |
Средний процент фагоцитирующих нейтрофилов |
76,5 (60,5–87,5) |
82,8 (78,5–92) |
|
Среднее число поглощенных бактерий на 1 мкл |
4,0 (3,3–4,9) |
4,88 (3,7–6,6) |
|
|
Мыши |
Процент фагоцитирующих нейтрофилов |
76,1 (71–79) |
68,5(48,3–76,1) |
|
Число поглощенных бактерий на 1 кл |
6,6 (5,6–7,9) |
6,1 (4,8–7,6) |
Примечание. *Отмечены результаты сравнений с интактной группой ( контроль) р < 0,05.
Таблица 4
Средние показатели НСТ-теста у морских свинок, крыс и мышей ( % метаболически активных клеток)
|
Группы животных |
Показатели НСТ-теста |
Зараженные МБТ (n = 10) |
Интактные (контроль n = 6) |
|
Морские свинки |
Базальный уровень, % |
47,4 (29,6–62,8)* |
64,6 (38,2–94,5) |
|
Стимулированный продигиозаном, % |
28,1 (16,5–44,7)* |
88,2 (48,3–100) |
|
|
Коэффициент стимуляции |
0,6 ( 0,3–0,7)* |
1,4 (0,6–1,8) |
|
|
Крысы |
Базальный уровень, % |
25,9 (21–35) |
21,4 (9–32) |
|
Стимулированный продигиозаном, % |
45,5 (40–58) |
47,6 (35–65) |
|
|
Коэффициент стимуляции |
1,88 (1,2–2,8) |
2,46 (1,9–4,4) |
|
|
Мыши |
Базальный уровень, % |
36,6 (31–46) |
26 (12–36) |
|
Стимулированный продигиозаном, % |
47,3 (35–54) |
54 (32–64) |
|
|
Коэффициент стимуляции |
1,3 (1,1–1,6) |
2,1 (1,2–2,5) |
Примечание. * Отмечены результаты сравнения с интактными животными (контроль) р < 0,05.
На фоне отмеченных метаболических сдвигов в печени, во многом обеспечивающей метаболитами антиоксидантные системы организма, существенные изменения претерпевают функционально – метаболические показатели лейкоцитов крови.
Установлено, что их фагоцитарная активность у морских свинок после заражения МБТ статистически значимо снижается как по числу фагоцитирующих клеток так и по числу поглощенных бактерий на 10–15 % (Р < 0,05). Метаболическая активность по НСТ-тесту так же подавлена примерно на 25 % (р < 0,05) и не восстанавливается после стимуляции продигиозаном (табл. 3, 4).
У крыс, после заражения микобактерией туберкулеза Н37Rv, такого угнетения фагоцитоза как у морских свинок, не наблюдается. Показатели остаются, примерно, на том же уровне что и в контроле.
При этом у крыс показатели генерации АФК в лейкоцитах (в НСТ – тесте) возрастают на базальном уровне (примерно на 20 % р < 0,05), тогда как при стимуляции продигиозаном этого не наблюдается. И даже напротив коэффициент стимуляции несколько снижен по отношению к контролю хотя и не достоверно (р > 0,05) (табл. 3, 4).
Обращает на себя внимание то обстоятельство, что у всех исследуемых животных снижаются показатели индекса стимуляции метаболической активности фагоцитов крови после введения им культуры МБТ Н 37Rv (табл. 4). То есть МБТ даже у устойчивых к ним крыс действуют угнетающе на фагоциты. Напомним, что супрессию фагоцитоза мы наблюдали и у человека при различных формах туберкулеза [1].
Отмеченные изменения в функциональной и метаболической активности лейкоцитов крови подопытных животных происходят на фоне значительных изменений в содержании в этих клетках глутатиона восстановленного и окисленного, а так же таурина. Так, если количество глутатиона восстановленного и окисленного в лейкоцитах морских свинок определяется в «следовых» значениях, как в контроле, так и после заражения, то у крыс его уровень составляет в контроле – 11,6 мкмоль/ л, а после заражения – 25,2 мкмоль/л, то есть увеличивается более чем в 2 раза (р < 0,01).
Существенны отличия и по содержанию таурина в крови экспериментальных животных. В контроле у морских свинок – 47,6 мкмоль/л, а после заражения – 41,5 мкмоль/л. У крыс – 124,8 мкмоль/л и 86,8 мкмоль/л, соответственно, то есть, так же как по глутатиону восстановленному отличие более чем в 2 раза (р < 0,01). Значительные отличия по содержанию глутатиона и аминокислот участвующих в его биосинтезе отмечены у морских свинок и крыс и другими авторами [8, 9]. Метаболические отличия во многом определяют специфичность формирования гранулем у этих двух видов животных после заражения МБТ[10].
Таким образом, метаболитов обеспечивающих стабильность мембран и поддерживающих метаболическую активность в лейкоцитах крыс в 2 раза больше, чем у морских свинок и после заражения концентрация их либо увеличивается, либо сохраняется на контрольном уровне.
Выводы
1. После заражения МБТ у всех зараженных морских свинок развивался генерализованный туберкулез с преимущественным поражением селезенки, печени, лимфоузлов, легких. У крыс, не смотря на то, что доза заражения была в 100 раз большей, чем у морских свинок, туберкулезный процесс не развивается.
2. МБТ действуют угнетающе на метаболическую активность фагоцитов крови всех исследуемых животных, но у устойчивых к туберкулезу крыс отчетливого угнетения фагоцитарной активности не наблюдается.
3. В защитных механизмах по отношению к МБТ у крыс преобладает генерация в лейкоцитах АФК с высоким уровнем антиоксидантной защиты в них процесс не развивался.
4. Решающее значение в межвидовой устойчивости к туберкулезу имеют особенности обменных процессов в печени и лейкоцитах крови-способность синтезировать в больших количествах АК и таурин, поддерживать в восстановленном состоянии глутатион.
5. Высокие показатели перечисленных метаболитов обеспечивают защитные свойства таких агрессивных биомолекул, как АФК и ВСА. И напротив при их недостатке АФК и ВСА начинают проявлять повреждающие свойства обуславливающие прогрессирование туберкулезного процесса.
Библиографическая ссылка
Павлов В.А., Котомцев В.В., Котомцев В.В., Медвинский И.Д., Сабадаш Е.В., Ершова А.В., Кравченко М.А. ФУНКЦИОНАЛЬНО-МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ В МЕЖВИДОВОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ К ТУБЕРКУЛЕЗУ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2015. – № 12-3. – С. 480-484;URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=7960 (дата обращения: 04.12.2024).