Научный журнал

Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Пивень А.В. 1 Золотавина М.Л. 1 Гудков Г.В. 2

---

1 ФГБОУ ВО «Кубанский государственный университет»

2 МБУЗ «ДГКБ № 1»

Выделение клеток фетального происхождения из крови беременной представляет большую актуальность для получения информации о геноме плода и реализации в широкой клинической практике скрининговых методов неинвазивной пренатальной диагностики. Но в настоящее время существует проблема подбора специфичных маркеров, методов сепарации и верификации материла. Материалом для исследования служила стабилизированная гепаринизированная цельная кровь беременных в сроках гестации 8-12 недель в объеме 10 мл. Обогащение выполняли методом градиентного центрифугирования и магнитной сепарации (CD45–) с флуоресцентным окрашиванием негативной фракции меченными антителами к антигенам трофобластов (HLA-G) для проведения проточной цитометрии и сортировки клеток на предметные стекла. Фетальное происхождение генетического материала подтверждали сопоставлением аллелей HLA генов родителей и клеток-кандидатов. Предложенные подходы к выбору антител к специфическим антигенам трофобластов для обеспечения эффективных способов их обогащения, захвата и высокопроизводительной сортировки на основе проточной цитометрии, а также надежные методы верификации принадлежности плоду клеток-кандидатов позволят существенно повысить достоверность и универсальность неинвазивной пренатальной диагностики.

Статья в формате PDF

1421 KB

неинвазивная пренатальная диагностика

трофобласты

HLA

проточная цитометрия

1. Екимова Е.В., Екимов А.Н., Алексеева М.Л. Роль молекулярных методов диагностики в преимплантационном скрининге эмбрионов (обзор литературы) // Проблемы репродукции. – 2012. – № 6. – С. 56-59.

2. Молекулярно-генетические методы в пренатальной диагностике хромосомных аномалий / Буяновская О.А. и др. // Акушерство и гинекология. – 2012. – № 8, Т. 1 – С. 3–9.

3. Получение и применение динамических стандартных референсных интервалов для анализа результатов сравнительной геномной гибридизации / Миньженкова М.Е. и др // Генетика. – 2013. – Т. 49, № 10. – С. 1229-1235.

4. Characterization of fetal cells from the maternal circulation by microarray gene expression analysis-could the extravillous trophoblasts be a target for future cell-based non-invasive prenatal diagnosis? / Hatt L and et // Fetal Diagn Ther. – 2014; – 35(3), – P. 218-227.

5. Clinical potential for noninvasive prenatal diagnosis through detection of fetal cells in maternal blood / Purwosunu Y. and et // Taiwanese journal of obstetrics & gynecology, – 2006, – 45(1):10-20.

6. Detection of chromosomal aneuploidies in fetal cells isolated from maternal blood using single-chromosome dual-probe FISH analysis / Calabrese G and et // Clin Genet, – 2012, – 82: – P. 131–139.

7. Fetal Cells in Maternal Blood: A Comparison of Methods for Cell Isolation and Identification. / Christensen B and et// Fetal Diagnosis and Therapy, – 2005; – 20, – Р 106-112.

8. Non-invasive prenatal testing: a review of international implementation and challenges / Allyse M and et // International journal of women’s health, – 2015, – 7, – P. 113-126.

9. Validation of targeted sequencing of single-nucleotide polymorphisms for non-invasive prenatal detection of aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y / Nicolaides K.H. and et // Prenatal Diagnosis. – 2013. –V.33, 6. – Р. 575-579.

10. Zimmerlin L, Donnenberg VS, Donnenberg AD. Rare event detection and analysis in flow cytometry: bone marrow mesenchymal stem cells, breast cancer stem/progenitor cells in malignant effusions, and pericytes in disaggregated adipose tissue. // Methods Mol Biol 2011, – P. 251–273.

Во всех развитых странах активно ведутся исследования по разработке и внедрению методов неинвазивной пренатальной диагностики, с использованием редких плодных клеток из кровотока беременной, находящихся там вследствие их трансплацентарной трансфузии или свободной внеклеточной ДНК (вкДНК) плода [2].

При анализе свободной вкДНК плода в материнской крови, возникает проблема верификации генетической информации плода [10]. Эта проблема решается применением метода массового параллельного секвенирования нового поколения (NGS) с применением сложных алгоритмов биоинформатики, что обуславливает высокую стоимость данного метода и тормозит его внедрение в акушерскую практику [1].

Другая технология – захват клеток плода, циркулирующих в крови матери, несущих фетальную ДНК, значительно проще в применении [8]. Однако, при данном подходе также стоит задача верификации выделенных из кровотока плодных клеток от материнских, что становится особенно актуальным при недостатке специфических маркеров к антигенам плодового происхождения экспрессированных на захваченных клетках; ДНК из единственной захваченной клетки подвергается полногеномной амплификации, в связи, с чем крайне важным является однозначно верифицировать исследуемую клетки-кандидаты на ее плодовое происхождение[7].

Наиболее перспективными для неинвазивной пренатальной диагностики являются клетки трофобласта [5]. Для их выделения из кровотока матери широко используют метод флуоресцентно-активированной сортировки (ФАКС) на проточном цитометре [10]. Несмотря на использование в ходе сортировки моноклональных антител к специфическим антигенам трофобластов необходима дополнительная верификация генетического материала захваченных клеток. Для этого применяют ряд методов, целью которых является поиск у клеток плода признаков отсутствующих у клеток матери. Например, наиболее доступными маркерами в случае вынашивания плода мужского пола является Y-хромосома (выявляют при помощи FISH), наличие у плода Rh-фактора при его отсутствии у матери и другие [4, 6]. Однако, по нашему мнению, эти способы не являются универсальными, а их точность не достаточна, по сравнению с более точным HLA-генотипированием, результаты которого однозначно свидетельствовали о происхождении выделенных клеток-кандидатов.

Поэтому актуальной проблемой являются поиск наиболее надежных способов верификации фетального происхождения клеток-кандидатов для повышения достоверности и универсальности неинвазивной пренатальной диагностики [3].

Цель настоящего исследования заключалась в модификации и улучшении эффективности методов сепарации, сортировки, HLA-генотипирования трофобластов циркулирующих в кровотоке матери для неинвазивной пренатальной диагностики.

Материалы и методы исследования

В ходе исследования были проанализированы образцы периферической крови, полученные у 10 женщин с одноплодной физиологически протекающей беременностью в сроках гестации 8-12 недель. У 8 женщин настоящая беременность была первой, остальные в анамнезе имели беременности с вынашиванием плода мужского пола.

Кровь наслаивали на градиент Histopaque-1077 (плотность 1,077 г/мл) и разделяли образец центрифугированием. Полученный образец мононуклеарных клеток (~ 1×108 клеток в 800 мкл) подвергали негативной по CD45 иммуномагнитной сепарации. Обогащенную целевыми клетками (трофобластами) негативную фракцию окрашивали моноклональными антителами anti-HLA-G, меченными аллофикоцианином (АРС) и anti-Trop-2 меченными тетраметилродамин-изотиоцианатом (TRITC). Далее на проточном цитометре-сортере «BD FACS AriaIII» (BD Biosciences, США) с использованием сопла диаметром 85 мкм проводили сортировку трофобластов на предметные стекла порытые мембраной с низкой автофлуоресценцией («MembraneSlide 1.0 PET», Carl Zeiss GmbH, Германия). После сортировки клеток предметное стекло переносили на систему лазерной микродиссекции «PALM® MicroBeam» (Carl Zeiss GmbH, Германия). С одного слайда вырезали и катапультировали в отдельную ПЦР-пробирку до 10 клеток, удовлетворяющих критериям отбора.

Следующий этап включал проведение полногеномной амплификации ДНК из единичных клеток в каждой пробирке при помощи набора реагентов «SurePlex DNA Amplification System» (Illumina, США) и амплификатора T-100 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). В ходе полногеномной амплификации получали высокую концентрацию мультикопий нативной ДНК единственной клетки, обеспечивающей достаточную репрезентативность ее генома.

Полученную ДНК клетки после очистки использовали для проведения HLA-генотипирования по локусам (А, В, С, DQB1, DRB1, DPB) на приборе «Luminex 200» (Hologic, Inc., США) с использованием наборов реагентов «LifeCodes HLA Typing Kits». На основании сравнения HLA-генотипов амплифицированной ДНК из клеток-кандидатов с HLA-генотипами ДНК, выделенной из крови родителей, проводили достоверную верификацию фетального происхождения диссектированных клеток-кандидатов.

Средние значения сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента. Нулевую гипотезу отвергали при р > 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Используя данный метод были проанализированы 10 образцов периферической крови, полученные у женщин с одноплодной физиологически протекающей беременностью в сроках гестации 8-12 недель.

Среднее число выделенных клеток в 800 мкл образца составило 1,05 ± 0,12× ×108 клеток (среднее ± SE), что соответствовало средней концентрации ~ 1×108 клеток/мл. После обогащения клетками негативными относительно панлейкоцитарного антигена (CD45) при помощи магнитной сепарации степень истощения во всех образцах превышала 95 % (97,7 ± 1,34 %), что соответствовало в негативной фракции 2,71 ± 0,46 млн. клеток. В ходе сортировки на предметные стекла среднее число клеток-кандидатов, удовлетворяющих критериям CD45–HLA-G+anti-TBA+ составило 37,6 ± 5,38 клеток.

С каждого слайда вырезали по 10 единичных клеток, которые катапультировали в отдельные ПЦР-пробирки для проведения полногеномной амплификации (всего 100 исследований). Полногеномная амплификация позволяла получить количество ДНК в образце, достаточное для последующего анализа HLA-генотипа. Электрофоретический контроль амплификации ДНК во всех пробах был положительным, а средняя концентрация ДНК из диссектированных единичных клеток после очистки составила 47,5 ± 7,4 нг/мкл.

Среди 10 клеток-кандидатов, отбираемых с каждого слайда, HLA генотипы из комбинаций родительских аллелей выявляли в 7,4 ± 1,35 клетках (74 %), что достоверно подтверждало их фетальное происхождение. Остальные клетки (2,6 ± 0,76) имели HLA генотип матери, что свидетельствовало о неспецифическом их захвате в ходе сортировки. Оценка полученных результатов по показателям чувствительности и специфичности составила 100 % и 74 %, соответственно.

Выводы

Таким образом, среди существующих способов верификации плодных клеток для неинвазивной пренатальной диагностики использованный нами метод является относительно простым, и позволяет однозначно определить плодное происхождение клеток-кандидатов, а также использовать результаты исследования в других целях.

Использование надежных методов верификации принадлежности плоду клеток-кандидатов таких как HLA типирование по 6 локусам (А, В, С, DQB1, DRB1, DPB) 1 и 2 класса гистосовместимости может существенно повысить достоверность и универсальность неинвазивной пренатальной диагностики.

Библиографическая ссылка