В исследованиях последних лет значительное место занимает разработка методов, позволяющих контролировать изменения содержания эндогенных нейромедиаторов, осуществляющих регуляцию физиологических процессов, направленных на адаптацию организма к изменяющимся условиям внутреннего и внешнего окружения, препятствующих развитию патологических процессов. В связи с этим, создание диагностических тестов определения и мониторинга эндогенных биорегуляторов является актуальной задачей. Как правило, для обнаружения этих веществ используют физико-химические методы анализа, чаще всего основанные на различных видах хроматографии или иммунохимические способы-радиоиммунный, иммуноферментный и иммунофлюоресцентные анализы (РИА) и (ИФА) [1, 2].Основным инструментом в разработке указанных методов являются антитела. Именно от иммунохимических свойств антител зависит чувствительность и специфичность определения эндогенного биорегулятора. Известно, что гистамин является регулятором многих жизненно важных функций организма [3] и играет большую роль в патогенезе ряда болезненных состояний. Появляется в крови при патологических процессах (анафилактический шок, ожоги, крапивница и аллергические заболевания), при поступлении в организм некоторых химических веществ (к ним относятся психоактивные и токсические вещества) [4]. Отмечена высокая информативность определения гистамина в оценке клеточного звена иммунной системы. Клинический интерес представляет измерение количества высвобождаемого гистамина из базофилов при гиперчувствительности немедленного типа и количество гистамина в различных биологических жидкостях (плазма, моча, супернатант клеточных культур) после контакта с аллергеном [5].
Целью данного исследования являлась разработка твердофазного ИФА определения гистамина на основе антител, индуцированных иммунизацией и выделенных аффинной хроматографией из сыворотки крови кролика, установлении возможности диагностического применения метода.
Материалы и методы исследования
В работе использовались бычий сывороточный альбумин (БСА), овальбумин (Ова) («Sigma»), Сефадекс С-25, NSH-активированная сефароза («Sigma»,«Pharmacia»), полистирольные планшеты фирмы «Nunc». Осаждение IgG проводили октановой кислотой («Sigma»). Сравнительное определение содержания гистамина в сыворотке крови проводили методом хроматографии (ВЖХ).
Для выявления специфичности ИФА использовали в качестве ингибиторов соединения, схожие по структуре и физиологической функции гистамину (сротонин, дофамин), а также некоторые пептидные нейромедиаторы (-эндорфин, дерморфин).
Синтез коньюгатов гистамина с белками осуществляли методом смешанных ангидридов. В качестве функциональной группы, способной ковалентно связываться с белками в мягких условиях, использовали содержащуюся в гистамине свободную карбоксильную группу (1). Синтезированы коньюгаты с БСА (Гис-БСА) и Ова (Гис-Ова). Количество молей гистамина, связанных с одним молем белка, определяют с помощью тринитробензолсульфокислоты по разнице свободных аминогрупп в исходном белке и полученном коньюгированном антигене.
Для синтеза коньюгатов (Гис-БСА) растворяли 54 мг соединения (1) в 800 мкл безводного диметилформамида (ДМФА), добавляли при охлаждении и перемешивали 36 мкл безводного триэтиламина и 25 мкл изобутилхлорформиата. Через 40 мин. образовавшийся раствор при перемешивании по каплям добавляли к раствору 100 мг БСА в 8 мл 0,25 М натрия бикарбоната. Реакционную смесь оставляли на 18 ч. при 4 °С. Далее синтезированный коньюгат Гис-Бса выделяли гель-хроматографией на колонке с сефадексом С-25. Полученный коньюгат Гис-БСА по данным УФ-спектров содержал 20 молей (1) на один моль белка.
Коньюгат Гис-Ова синтезируют аналогично описанной методике, используя при этом следующие соотношения реагентов: 1 мг (1) растворяли в 0,1 ДМФА и добавляли 6,3 мкл изобутилхлорформиата в присутствии 1 мкл триэтиламина. Образовавшийся смешанный ангидрид приливали к раствору 30 мг Ова в 5 мл. 0,25 М натрия бикарбоната. Синтезированный антиген выделяли гель-хроматографией на колонке с сефадексом С-25. Полученный коньюгат содержал 5 молей (1) на 1 моль Ова.
Для получения специфических антител использовали 6 кроликов-самцов массой 2,5 кг. Иммунизацию проводили введением коньюгата из расчета 1 мг на кролика в виде 50 % эмульсии водного раствора Гис-БСА и полного адьюванта Фрейнда. В течение 1 мес. с интервалом 7 суток проводили внутрикожные инъекции по 0,2 мл. в точки вблизи позвоночника – в области лопаток и крестца. Реиммунизацию осуществляли ежемесячно, вводя по 0,5 мг коньюгата внутримышечно.
Через 3 мес. брали кровь и определяли титр полученных антисывороток, используя прямой ИФА. С этой целью в лунки планшета вносили по 100 мкл растворов коньюгатов Гис-Ова и Гис-БСА в концентрации от 10 мкг/мл до 100 нг/мл соответственно в 0,2М карбонатбикарбонатном буфере (pH 9,6). Планшеты инкубировали в течение 2 ч при 37 °С, отмывали забуферным физиологическим раствором (ЗФР), содержащем 0,005 % твин-20, стряхивали, а затем в лунки планшета добавляли по 100 мкл кроличьих сывороток, используя серию двойных разведений от 1:10 до 1:106 в ЗФР, содержащем 0,01 %твин-20. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37 °С, отмывали (как описано выше), далее добавляли по 100 мкл в лунку коньюгата овечьих антител к иммуноглобулинам кролика, меченных ПХ в разведении 1:1000. Планшеты выдерживали в течение 45 мин (как описано выше) и вносили по 100 мкл субстратной смеси (0,04 % о-фенилендиамин, 0,02 % перекись водорода в фосфатно-цитратном буфере (pH 5,0), инкубировали в течение 15 мин в темноте. Ферментативную реакцию останавливали добавлением 50 мкл 10 % серной кислоты и измеряли оптическую плотность при 492 нм на спектрофотометре «Multiskan». Из сыворотки, имеющей наиболее высокий титр (1:6000), выделяли у-глобулиновую фракцию по методу с октановой кислотой.
Осаждение IgG из сыворотки кролика проводили октановой кислотой. В течение ночи в холодильнике при температуре 2-8 °С размораживают пул сыворотки крови кроликов. В колбу с плоским дном помещают 20 мл сыворотки, затем, добавляют двойной объём ацетатного буфера (40 мл) и перемешивают содержимое на магнитной мешалке, при низкой скорости. Постепенно в течение 30 минут добавляют 1,50 мл (из расчёта 0,75 мл на каждые 10 мл сыворотки) октановой кислоты (каждую минуту по 50 мкл). После добавления последней части октановой кислоты смесь инкубируют при помешивании с низкой скоростью ещё 30 минут. Далее смесь делят поровну на 2 пробирки (50 мл) и центрифугируют при 10000g в течение 10 минут при комнатной температуре. Полученный серо-белый осадок отбрасывают. Супернатант (40 мл) фильтруют через фильтр 0,45mm вакуумным насосом. Полученный супернатант диализуют против фосфатного буфера (рН = 7,4, 10-кратный объём: 400 мл).
Для выделения антител используют аффинную хроматографию на колонке с сефарозой. Предварительно сорбент, NSH-активированную сефарозу, содержащую в своем составе карбоксильные группы, активированные N-окси – сукцинимидным эфиром, обрабатывают 0,1 М раствором гистамином в фосфатно- солевом буфере рН = 7,4 в соотношении 1:50. Полученный сорбент используют для аффинной хроматографии кроличьих антител. Для этого колонку с активированной гистамином сефарозой отмывают фосфатным солевым буфером до рН = 7,4 (100 мл). Заливают продукт (кроличьи IgG) объёмом 15 мл в колонку. Аккуратно перемешивают содержимое до гомогенного состояния и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Отмывают несвязавшиеся антитела фосфатным солевым буфером и далее собирают фракцию антител с глициновым буфером (pH = 2,5) в приёмник и нейтрализуют до рН = 7,2. Полученный элюат антител используют в иммуноферментном анализе.
Твердофазный ИФА для количественного определения гистамина проводили в полистирольных планшетах. Для этого в лунки планшета сорбировали антиген Гис-Ова в концентрации 2 мкг/мл в течение 18 ч при 4 °С в 0,05 М карбонат- бикарбонатном буфере с pH 9,6. Затем планшеты отмывали ЗФР, содержащим 0,005 % твин-20. Аликвоты анализируемых образцов сыворотки крови (по 10 мкл), а также образцы с известными концентрациями гистамина, разведенные в 5 раз смесью ЗФР с 0,01 % твин-20, смешивали с раствором аффинно выделенных антител против гистамина (50 мкл) предварительно разведенных тем же буфером до соотношения 1:400. Смесь встряхивали и наносили в лунки планшета на иммобилизованный антиген, а затем инкубировали 1ч при 37 °С. Для выявления образования иммунных комплексов в планшеты после отмывания добавляли по 100 мкл в лунку коньюгата овечьих антител к иммуноглобулинам кролика, меченных ПХ в разведении 1:1000. Планшеты выдерживали в течение 45 мин. Далее, проводят процедуру ИФА аналогично описанной выше. Определение специфичности, полученных при иммунизации антител, проводили ИФА, используя в качестве ингибиторов набор соединений указанных выше в концентрации от 0,5 мг/мл до 1,0 нг/мл. Для каждого соединения в ИФА определяли концентрацию, при которой происходит 50 % торможение взаимодействия специфических антител с коньюгатом Гис-Ова. Специфичность определяли как выраженное в процентах отношение найденных молярных концентраций исследуемого ингибитора и гистамина.
Результаты исследования и их обсуждение
Для получения специфических антител против гистамина по разработанной нами схеме проводили иммунизацию кроликов коньюгированным антигеном Гис-БСА, синтезированным по описанной выше методике. Иммунохимические свойства полученных кроличьих антисывороток анализировали прямым ИФА, причем было установлено, что титры антител на гаптен и белок-носитель у различных животных варьируют в широком интервале от 1:800 до 1:6400 (табл. 1), в случае использования в качестве антигена Гис-Ова, и от 1:6400-1:100000 при иммобилизации на планшет Гис-БСА
Таблица 1
Условия проведения иммуноферментного анализа антител к гистамину на различных белках носителях в сыворотке крови
|
Наименование антигена |
Диапазон разведения антигена мкг/мл |
Диапазон разведения сыворотки |
|
Гис-Ова |
1-10 мкг/мл |
1: 800 – 1 : 6400 |
|
Гис-БСА |
1-10 мкг/мл |
1: 6400 – 1 : 100000 |
Титр сыворотки устанавливали как конечное разведение, при котором значение оптической плотности при 492 нм в ИФА втрое превышало фоновое значение.
Известно из литературных данных, что клинические эффекты гистамина зависят от его концентрации в плазме. Повышение желудочной секреции кислоты и сердечного ритма происходит при содержании 1-2 нг/мл. Проявление тахикардии, головной боли, приливов, крапивницы регистрируется при 3-5 нг/мл. Снижение артериального давления – 6-8 нг/мл. Бронхоспазм – 7-12 нг/мл. Остановка сердца около 100 нг/мл [3].
Поэтому, помимо высокой технологичности, простоты проведения анализа отсутствия сложной пробоподготовки анализируемого вещества, метод определения гистамина должен обладать высокой чувствительностью и специфичностью. Твердофазный ИФА основан на конкуренции меченного и свободного гаптена, находящегося в анализируемой пробе, за связывание со специфическими антителами. Для его разработке необходимо наличие специфических антител и конъюгата гаптена с макромолекулярным носителем. Из сыворотки кролика, имеющей наиболее высокий титр на гаптен (1:8000) выделяли у-глобулиновую фракцию с помощью октановой кислоты. Далее проводили аффинную хроматографию антител и использовали их при разработке ИФА. В качестве второго реагента для ИФА применяли коньюгат Гис-Ова.
Твердофазный метод ИФА включает в себя следующие этапы: иммобилизацию коньюгированного антигена на полистирольном планшете; конкурентное связывание свободного производного гистамин, присутствующего в анализируемом образце, и адсорбированного на твердой фазе коньюгата Гис-Ова со специфическими антителами; выявление образовавшегося иммунного комплекса с помощью антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена; измерение ферментативной активности в образовавшемся иммунном комплексе.
На основании данных полученных при анализе связывания коньюгата Гис-Ова с антителами в зависимости от количества присутствующего в пробе свободного гистамина, строили калибровочную кривую. Максимальная чувствительность метода составляет 2,50 нг/мл, 50 %-ное ингибирование взаимодействия специфических антител, с коньюгатом Гис-Ова, иммобилизованным в лунках полистирольного планшета, происходит при добавлении 5,0 нг/мл свободного гистамина.
Специфичность метода была исследована конкурентным ИФА при добавлении в реакциионную среду соединений, родственных гистамину(сротонин, дофамин), а также ряда других препаратов (-эндорфин, дерморфин) (табл. 2).
Таблица 2
Специфичность метода ИФА для определения амфетаминов
|
Соединение |
Ингибирование % |
|
Гистамин |
100 |
|
Сротонин |
2,0 |
|
Дерморфин |
1,3 |
|
Дофамин |
0,7 |
|
-эндорфин |
1,1 |
Из табл. 2 видно, что указанные вещества, не тормозят специфическую реакцию взаимодействия антител и антигена даже в концентрации 0,5 нг/мл. Следовательно, разработанный ИФА является специфичным для выявления производных класса гистамина.
Для выявления диагностической значимости разработанного ИФА было проведено определение гистамина в 20 образцах сыворотки крови пациентов с аллергическими заболеваниями. В этих образцах определяли содержание гистамина, используя метод ВЖХ, который широко применяют для подтверждения содержания эндогенных веществ в образцах биологической жидкости. Было установлено, что с помощью разработанного метода ИФА обнаружено увеличение содержания гистамина в 80 % исследуемых образцах. По данным ВЖХ выявлено 50 % образцов, положительных по содержанию гистамина. Отсюда следует, что разработанный ИФА по чувствительности превосходит ВЖХ и может быть рекомендован для использования в лабораторной медицинской практике. Дальнейшее проведение исследований позволит уточнить диагностические возможности использования разработанного метода.
Заключение
Таким образом, разработан конкурентный ИФА количественного определения гистамина в сыворотке крови с использованием кроличьих аффинно очищенных специфических антитела и синтетического антигена, полученного из производного гистамина и овальбумина. Предварительные исследования показали возможность использования данного метода в медицинской практике.
Библиографическая ссылка
Другова Е.Д., Мягкова М.А. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТАМИНА // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2016. – № 6-5. – С. 891-894;URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=9721 (дата обращения: 23.11.2024).