Научный журнал

Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Ляпина М.Г. 1 Успенская М.С. 1 Майстренко Е.С. 1

---

1 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Разработан метод получения эффективного антикоагулянтного экстракта из корней пиона молочноцветкового ( Paeonia lactiflora). По данным нескольких коагулологических методов исследования (тромбоэластографического, активированного частичного тромбопластинового времени, тромбинового и протромбинового времени) экстракт из пиона обнаруживал высокие антикоагулянтные свойства. Расшифрован механизм противосвертывающего действия активного экстракта из пиона, который заключается в ингибировании активности фермента тромбина, фактора Ха и конечного этапа процесса свертывания крови – образования фибринового сгустка. Отмечено, что экстракт из пиона удлиняет тотальную константу свертывания и влияет на эластичность сгустка, отражающую его плотность. В перспективе экстракт может применяться как нетоксичный антикоагулянтный препарат, не вызывающий побочного геморрагического действия на организм. Гепариноподобные низкомолекулярные компоненты экстракта из пиона молочно-цветкового идентичны низкомолекулярному гепарину животного происхождения.

Статья в формате PDF

915 KB

антикоагулянт

кровь

корни пиона молочноцветкового

механизм действия

1. Гриневич М.А. Информационный поиск перспективных лекарственных растений. – Л., 1990. – С. 25–28.

2. Ляпина Л.А., Аммосова Я.М., Новиков В.С., Смолина Т.Ю., Пасторова В.Е., Успенская М.С. К вопросу о природе антикоагулянта, полученного из корней пионов средней полосы России // Известия РАН, сер. биологическая. – 1997. – № 2. – С. 235–237.

3. Ляпина Л.А., Григорьева М.Е., Оберган Т.Ю., Шубина Т.А. Теоретические и практические вопросы изучения функционального состояния противосвертывающей системы крови. – М.:Адвансед Солюшнз, 2012. – 160 с.

4. Ляпина Л.А., Кондашевская М.В., Пасторова В.Е., Успенская М.С., Новиков В.С. Противотромботические эффекты экстракта из корней пиона молочноцветкового // Тромбоз, гемостаз и реология. – 2000. – № 2 (2). – С. 37–39.

5. Регистр лекарственных средств РЛС. Энциклопедия лекарств – 19-й вып. / Под ред. Г.Л. Вышковский. –М. «РЛС-Медиа». – 2010. – 1368 с.

6. Успенская М.С., Мурашев В.В., Криницина А. Древовидные пионы в Ботаническом саду МГУ / Под ред. Мурашева В.В. – М.: Лесная страна, 2016. – 104 с.

7. Rabenstein D.L. Heparin and heparin sulfate: structure and function // Nat. Prod. Rap. – 2002. – Vol.19. – P. 312–331.

8. Stief T.W. Inhibition of thrombin in plasma by heparin or arginine // Clin. Appl.thromg.hemost. – 2007. – Vol. 13. – № 2. – С. 146–153.

Пион молочноцветковый (Paeonia lactiflora), белоцветковый или китайский произрастает в Монголии, Китае, Приморье, Забайкалье по склонам сопок, по берегам рек, в зарослях дуба монгольского. Наибольшее количество травянистых пионов произошло от молочноцветкового. В отличие от других дикорастуших травянистых пионов Р.lactiflora стоит на одном из первых мест по устойчивости к засухе, морозам и серой гнили. Он широко используется в озеленении, а настои корневищ широко применяют в китайской медицине в качестве болеутоляющего, противосудорожного, спазмолитического, противовоспалительного и нормализующего кровяное давление средства [1,6]. Ранее было показано, что в корнях пионов содержится гепариноподобный компонент с низкой молекулярной массой (до 6 кDa) [2,4]. Известно, что стандартный гепарин, полученный из тканей животных, замедляет процессы фибринообразования за счет присущего ему антикоагулянтного действия [7,8]. В клинической практике применяются высоко- или низкомолекулярные гепарины в основном животного происхождения. Однако, высокомолекулярный гепарин при передозировке имеет побочное действие в виде тромбоцитопений, «рикошетных эффектов» или геморрагий [5]. Низкомолекулярные формы гепаринов практически не имеют указанных отрицательных последствий на организм, но они в основном иностранного производства. До сих пор продолжается поиск безопасных отечественных антикоагулянтов без побочных отрицательных воздействий на организм. К таким антикоагулянтам могут относиться вещества растительной природы. Поэтому проблема изучения антикоагулянтов растительного происхождения и исследование механизма их действия на свертывание крови актуальны и в настоящее время.

Цель работы заключалась в разработке оптимального способа получения экстракта из корней пиона молочноцветкового (Paeonia lactiflora), исследовании его влияния на различные звенья гемостаза и расшифровке возможных механизмов его антикоагулянтного действия.

Материалы и методы исследования

В работе использовали свежие корни пиона молочноцветкового (КПМ), выращенного в Ботаническом саду МГУ имени Ломоносова. Мы разработали наиболее оптимальный способ получения антикоагулянтного экстракта из КПМ, для чего корни промывали водопроводной водой, высушивали при 37С в течение 24 часов, освобождали от коры, а сухую сердцевину растирали в фарфоровой ступке не менее 20–30 мин. Далее взвешивали препарат и для получения его начального 5 %-го раствора использовали 0,85 %-й раствор NaCl. Через 20–24 ч стояния раствора пиона при 37С его подвергали центрифугированию в течение 10 мин при 3000 об./мин. Супернатант (экстракт) использовали в дальнейших экспериментах.

Исследовали влияние полученного экстракта из пиона (ЭП) на гемостазиологические параметры [3] в условиях in vitro, для чего к крови или к плазме добавляли ЭП из расчета на 0.3 мл крови или плазмы 0.02 мл ЭП. Инкубировали эти растворы в течение не менее 3-5 мин и записывали следующие параметры тромбоэластографии (ТЭГ) на приборе Hellige (Германия) – «R» (фаза тромбопластино- и тромбинобразования), «К «(фаза фибринообразования), «ma» (максимальная амплитуда, свидетельствующая об изменении /повышении или снижении/ концентрации фибриногена), «t» (при удлинении свидетельствует об активации антикоагулянтной активности), «S»(константа синерезисa = R + t, свидетельствует об уплотнении сгустка). «Т» (тотальная константа свертывания) , «Е» (эластичность сгустка, отражающая плотность сгустка). Кроме того, на приборе анализатор свертывания крови АСКа-2-01 АСТРА (Россия) определяли протромбиновое время (ПВ), тромбиновое время (ТВ) и активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) [3] для характеристики внешнего, внутреннего и общего путей свертывания крови. В экспериментах использовали лабораторных белых крыс–самцов массой тела 180–200 г, из v,jugularis которых брали кровь с использованием в качестве консерванта 3.8 %–ный лимоннокислый натрий в соотношении 9:1 (для тромбоэластографического метода), которую затем подвергали центрифугированию при 2000 q в течение 10–12 мин для получения бестромбоцитарной плазмы. Эта плазма использовалась для определения АЧТВ, ПВ, ТВ.

Статистическая обработка данных проведена согласно методу Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что ЭП в начальной концентрации 5 % по всем тестам обнаруживает значительную антикоагулянтную активность, превышающую контрольные значения в 1.8-2.6 раза. По данным ТЭГ выявлено по сравнению с контролем, что показатель «R» удлиняется в 1.8 раза, что свидетельствует об ингибирующем действии ЭП в процессах образования тромбина и фактора Ха, показатель «K» при этом удлиняется в 2.6 раза, что, во-первых, указывает на возникновение гипокоагуляции, обусловленной антитромбиновым потенциалом крови, во-вторых, на участие ЭП в предотвращении образования фибринового сгустка. Показатель «K», как известно, зависит от концентрации образующегося тромбина, концентрации и функциональной полноценности фибриногена и факторов протромбинового комплекса, которые, судя по полученному результату, значительно снижены. Показатель «Т» ТЭГ в опытных пробах удлиняется в 2.27 раза, что указывает на активацию антикоагулянтной активности крови под влиянием ЭП. Константа синерезиса, показатель «S» ТЭГ, в опыте превышает контрольный уровень в 2.3 раза, т.е. процесс уплотнения сгустка в опыте происходит значительно медленнее контроля за счет антикоагулянтного действия ЭП (таблица).

Гемостазиологические параметры после инкубации экстракта из пиона молочноцветкового с кровью крыс (средние данные из 7 проб в каждой группе) (М±m)

Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля. Обозначения: **р < 0.01; *p < 0.05.

Нами установлено, что показатель ПВ, характеризующий внешний путь свертывания и отражающий чувствительность к дефициту факторов протромбинового комплекса (VII, X, V, II) в опытных пробах (ЭП) превышал контрольные значения в 1.7 раза. Эти данные свидетельствуют, что механизм антикоагулянтного действия ЭП обусловлен его ингибированием факторов протромбинового комплекса – тромбина, фактора Ха, в меньшей степени факторов V и VII. Дополнительный тест по влиянию ЭП на изменение АЧТВ, характеризующий внутренний путь свертывания, показал удлинение АЧТВ в опыте по сравнению с контролем в 1.4 раза. Это указывает на влияние ЭП на начальный этап внутреннего механизма свертывания и показывает дефицит всех плазменных факторов свертывания, кроме фактора VII. Установлено также, что ТВ в опыте удлиняется в 2.0 раза по сравнению с контролем, что подтверждает полученные нами данные ТЭГ по ингибированию активности фермента тромбина под влиянием ЭП. Таким образом, антикоагулянтные эффекты ЭП связаны в основном с ингибированием активности тромбина, фактора Ха и других факторов свертывания крови, участвующих в образовании фибрина. Кроме того, это обусловлено и блокадой других факторов внутреннего механизма свертывания крови, но уже в меньшей степени.

Поскольку известно, что низкомолекулярные формы гепариноподобных компонентов присутствуют в корнях пионов [2], а в клинике для борьбы с тромботическими осложнениями без проявления побочного действия используется низкомолекулярный гепарин, но только животного происхождения, то весьма перспективными могут быть исследования растительных гепариноподобных препаратов с антикоагулянтной активностью.

Заключение

Разработан эффективный метод получения антикоагулянтного экстракта из корней пиона молочноцветкового. Метод предусматривает термостатирование (37С) при высушивании корней и получении экстракта. Установлено наличие в экстрактах высокой антикоагулянтной активности в условиях in vitro, что доказано различными коагулологическими методами (тромбоэластографическим, тестами АЧТВ, ПВ,ТВ). На основании полученных данных раскрыт возможный механизм антикоагулянтного действия экстракта, который заключается в ингибировании всех фаз процесса свертывания крови – образования протромбинового комплекса, в том числе фактора Ха, тромбина, а также процессов фибринообразования. Таким образом, действие антикоагулянтного растительного экстракта начинается уже с первых стадий процесса свертывания крови и протекает до конечного этапа – стадии фибринообразования, что указывает на его высокий антитромботический эффект. Это его действие соответствует эффектам низкомолекулярных форм гепарина животного происхождения.

Библиографическая ссылка