Бета-лактамные антибиотики (БЛА), в настоящее время являются наиболее широко используемым классом антибактериальных средств для лечения тяжелых инфекционных патологий, включая госпитальные инфекции. Основным фактором, ограничивающим клиническую эффективность БЛА, является способность микроорганизмов вырабатывать гидролитические ферменты бета-лактамазы, разрушающие их структуру и придающие устойчивость бактериям ко многим, а в некоторых случаях ко всем β-лактамным антибиотикам [7]. Прогрессирующее увеличение устойчивости к антибиотикам, опосредованное продукцией β-лактамаз, наблюдается во многих странах и ведет к многочисленным вспышкам инфекций. [2,8].
β-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) впервые были выявлены в середине 1980-х, в последние десятилетия устойчивость к БЛА за счет продукции БЛРС достигла масштабов эпидемии [7]. Синтез ферментов БЛРС обеспечивает бактериям устойчивость к β-лактамным препаратам широкого спектра, таким как пенициллины, азтреонам, а также к цефалоспоринам первого, второго и третьего поколения. Гены БЛРС локализуются на хромосомах или на мобильных генетических элементах плазмидах и транспозонах, это является важным драйвером возрастания резистентности в результате горизонтального переноса и клональной экспансии устойчивых штаммов [10].
Наиболее распространенными во всем мире возбудителями инфекций с множественной лекарственной устойчивостью являются бактерии семейства Enterobacteriaceae, преимущественно Klebsiella pneumonia. K. pneumoniae является важным патогеном нозокомиальных инфекций человека и наиболее распространенными грам – отрицательными бактериями с множественной лекарственной устойчивостью во всем мире. БЛРС- продуцирующие K. pneumoniae вызывают инфекции ассоциированные с мочевыводящей системой, желудно-кишечным и респираторным трактом [6].
Появление полирезистентных патогенов в амбулаторных условиях представляет собой серьезную проблему в борьбе с инфекциями и является фактором риска для дальнейшего распространения множественной лекарственной устойчивости к различным классам антибиотиков [8]. Исследования формирования и пространственной локализации антибиотикорезистентности, как многоцентровые, так и локальные являются важнейшим мероприятием по сдерживанию дальнейшего распространения патогенных организмов.
Цель данного исследования заключалась в выявлении БЛРС – продуцирующих штаммов Klebsiellа pneumoniae у амбулаторных пациентов, изучении их чувствительности к антибиотическим препаратам различных групп и распространенности генов бета-лактамаз расширенного спектра blaTEM-1,2, bla CTX-М.
Материалы и методы исследования
Для исследования были отобраны 36 изолятов Klebsiellа pneumoniae, выделенных из различных локусов организма амбулаторных пациентов г. Ростова-на-Дону в период с апреля по октябрь 2015 г. Критерием включения изолятов в исследование было снижение чувствительности хотя бы к одному из β-лактамных антибиотических препаратов до уровня, предлагаемого Национальным комитетом по клиническим лабораторным стандартам США – CLSI [5].
Чувствительность к антибиотическим препаратам определялась диско-диффузионным методом согласно рекомендациям и критериями, изложенным в Методических указаниях по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам [1].
Видовую идентификацию изолятов проводили с использованием тест-систем MIKRO-LA-TEST (PLIVA-Lachema Diagnostika s.r.o., Чехия) и автоматического бактериологического анализатора «VITEK-2 compact» (BioMerieux, Франция).
Для обнаружения генов-маркеров резистентности к пенициллинам blaTEM-1,2 и цефалоспоринам blaСТХ-M изоляты исследовали с помощью ПЦР. Для этого использовали ПЦР наборы ООО НПО “Литех” для обнаружения генетически обусловленной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам формата one step.
ДНК из суточной культуры исследуемых изолятов выделяли с помощью набора «ДНК-экспресс» (ООО НПФ «Литех», г. Москва), согласно инструкции.
ПЦР проводилась в амплификаторе “Терцик“ (ДНК технологии, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Продукты амплификации разделяли методом горизонтального электрофореза в 2 % агарозном геле. Анализ электрофореграмм проводили на трансиллюминаторе GelDoc (BioRad).
Результаты исследования и их обсуждение
Все отобранные для исследования изоляты были протестированы на чувствительность к антибиотикам различных групп: бета – лактамным препаратам пенициллинам (ампициллину, амоксициллину), цефалоспоринам I, II, III, IV поколения (цефазолину, цефуроксиму, цефотаксиму, цефепиму), карбапенемам (имипенему, дорипенему), а также к аминогликозидам (гентамицину) и фторхинолонам (ципрофлоксацину).
Было установлено, что 58.3 % K. pneumoniae устойчивы к цефазолину, цефотаксиму и цефепиму, резистентность к цефуроксиму составила 50 %. у 100 % изолятов зарегистрирована устойчивость к ампициллину, амоксициллину. Все исследованные изоляты оказались чувствительными к имипенему и дорипенему. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Чувствительность изолятов K. pneumoniae к БЛА (n=36)
Антибиотик |
Категория чувствительности (Количество микроорганизмов, %) |
|
R (Устойчивые) |
S (Чувствительные) |
|
Ампициллин |
36 (100 %) |
0 % |
Амоксициллин |
36 (100 %) |
0 % |
Цефазолин |
21 (58.3 %) |
15 (41.7) % |
Цефуроксим |
18 (50.0) % |
18 (50.0) % |
Цефотаксим |
21 (58.3 %) |
15 (41.7) % |
Цефепим |
21 (58.3 %) |
15 (41.7) % |
Имипенем |
0 % |
36 (100 %) |
Дорипенем |
0 % |
36 (100 %) |
Гентамицин |
2 (5 %) |
34 (95 %) |
Ципрофлоксацин |
3 (8 %) |
33 (8 %) |
Среди изолятов был выявлены образцы, обладающие множественной лекарственной устойчивостью не только к БЛА, а также к антибиотикам других групп: гентамицину и ципрофлоксацину – 2 и 3 изолята соответственно.
У части образцов одновременно зарегистрирована полирезистентность к пенициллинам и цефалоспоринам I-IV поколения, т.е. они экспрессируют фенотип БЛРС. Выраженная устойчивость к этим препаратам является следствием наличия у бактерий генов, кодирующих продукцию детерминант устойчивости к БЛА.
В нашем исследовании все изоляты были протестированы на наличие у них генов blaTEM-1,2 bla CTX-М. Результаты анализа генотипов представлены в табл. 2.
Таблица 2
Распределение генов β-лактамаз у K.pneumoniae устойчивых к БЛА
Тип β-лактамаз |
Количество исследованных изолятов |
Результат амплификации |
|
+ |
– |
||
TEM |
36 |
30.6 % (11) |
69.4 % (25) |
CTX-1,2 |
36 |
55.5 % (20) |
44.5 % (16) |
TEM, CTX-1,2 |
36 |
19.4 % (7) |
80.6 % (29) |
Положительные результаты амплификации blaTEM-1,2 и bla CTX-М зарегистрированы у 11 и 20 исследованных изолятов соответственно, т.о. относительная частота встречаемости bla CTX-М практически в 2 раза выше, чем blaTEM-1,2. при этом у 19.4 % K.pneumoniae обнаружены оба исследуемых гена.
Устойчивость к β-лактамным антибиотикам у бактерий реализуется за счет нескольких механизмов, включая продукцию различных энзимов, изменения конформации пенициллинсвязывающих белков, снижения проницаемости оболочки клетки и активного выведения АБП из микробной клетки (эффлюкса).
В настоящее время внимание исследователей обращено в основном на изучение трех основных групп ферментов бета-лактамаз, относящихся к молекулярному классу а – ТЕМ, SHV и СТХ-М, которые способны расщеплять не только антибиотики пенициллинового ряда и ранние цефалоспорины, но и цефалоспорины III и IV поколений. в каждой из этих гpyпп бета-лактамазы отличаются от основного фермента единичными аминокислотными заменами, которые расширяют спектр их ферментативной активности или приводят к возникновению устойчивости к ингибиторам [4]. у БЛРС-продуцирующих штаммов K. pneumoniae CTX-M является доминирующим, но TEM и SHV ферменты, а также β-лактамазы трех других классов (B, C, D) также детектированы и широко распространены. Резистентность к карбапенемам может ассоциироваться с продукцией карбопенемаз класса A KPCs, класса B металло-β-лактамаз (VIM, IMP, или NDM-1) или класса D OXA-тип энзимов [9].
Большинство субтипов ТЕМ и SHV бета-лактамаз являются БЛРС, способными расщеплять не только антибиотики пенициллинового ряда и ранние цефалоспорины, но и цефалоспорины III и IV поколений. Характерную для БЛРС активность проявляют также все ферменты СТХ-М типа [3].
Результаты анализа фенотипов и генотипов позволили установить, что резистентность к БЛА у 72 % исследованных изолятов ассоцирована с генами β-лактамаз blaTEM-1,2 и bla CTX-М.
В дополнение к БЛРС, устойчивость к бета-лактамам расширенного спектра у Enterobacteriaceae может быть опосредована другими плазмидами и ферментами, закодированными на хромосомах, такими как карбапенемазы и AmpC цефалоспориназы [2]. Многие гены БЛРС располагаются на больших плазмидах, на которых могут также присутствовать детерминанты устойчивости к другим классам антибиотиков к аминогликозидам, тетрациклиамн, сульфаниламидам или фторхинолонам. Это ведет к появлению БЛРС-продуцирующих патогенов с множественной лекарственной устойчивостью. в нашем исследовании также детектированы изоляты, обладающие множественной лекарственной устойчивостью к различным класса антибиотиков: БЛА, аминогликозидам и фторхинолонам.
Заключение
Полученные результаты показывают, что обнаруженная множественная лекарственная устойчивость у амбулаторных изолятов K.pneumoniae связана с производством генов β-лактамаз CTX-M и ТЕМ-1,2 и подтверждают потенциальную роль K.pneumoniae, как резервуара для БЛРС генов и других детерминант резистентности. Наличие патогенов устойчивых к современным антибиотикам не только у госпитализированных, но и у амбулаторных пациентов способствует распространению БЛРС среди здоровых людей, в общественных учреждениях и в окружающей среде.
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской федерации в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности № 1878 «Разработка фундаментальных аспектов молекулярной диагностики и митохондриальной фармакологии».
Библиографическая ссылка
Покудина И.О., Коваленко К.А. РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ И ВКЛАД В АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТЬ Β-ЛАКТАМАЗ У АМБУЛАТОРНЫХ ИЗОЛЯТОВ KLEBSIELLA PNEUMONIAE // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2016. – № 12-2. – С. 295-298;URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=10827 (дата обращения: 17.08.2024).