Научный журнал

Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Покудина И.О. 1 Коваленко К.А. 1

---

1 ФГАОУ ВО Южный федеральный университет

Исследована распространенность генов ферментов бета – лактамаз TEM-1,2, CTX-M и устойчивость к антибиотикам у изолятов Klebsiella pneumonia, выделенных у амбулаторных пациентов. Чувствительность исследованных изолятов к цефалоспоринам I – IV поколения составила 41.7 % – 50.0 %. у 100 % изолятов зарегистрирована устойчивость к пенициллинам и чувствительность к карбопенемам. у 58.3 % образцов отмечена множественная лекарственная устойчивость. Гены blaTEM-1,2 и bla CTX-М детектированы у 11 (30.6 %) и 20 (55.5 %) изолятов соответственно. при этом у 19.4 % изолятов обнаружены оба гена. в результате проведенного исследования установлено, что 72 % внебольничных штаммов K. pneumoniae устойчивость к бета-лактамам реализуется за счет продукции β-лактамаз, что является одним из ключевых факторов приобретения и распространения множественной резистентности к антибиотическим препаратам не только в стационарах, а также среди здоровых лиц и в различных объектах окружающей среды.

Статья в формате PDF

1331 KB

бета-лактамазы

устойчивость бактерий к антибиотикам

Klebsiella pneumoniae

1. Методические указания МУК 4.2.1890–04 «Оп­ределение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.). – М.: Федеральный центр госсанэпиднадзораМинздрава России, 2004.

2. Adwan G, Jaber AA. Frequency and molecular characterization of β-lactamases producing Escherichia coli isolated from North of Palestine // BMRJ 2016. V.11. P.1–13.

3. Bush K, Jacoby GA. Updated functional classification of beta-lactamases // Antimicrob Agents Chemother. – 2010. – №54. – P.969–76.

4. Braykov N.P., Eber M.R., Klein E.Y., Morgan D.J., Laxminarayan R. Trends in resistance to carbapenems and third generation cephalosporins among clinical isolates of Klebsiella pneumoniae in the United States, 1999–2010 // Infect Control Hosp Epidemiol. – 2013. – V.34. №3. – P. 259–68.

5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing: Twentieth Informational Supplement (June 2009 Update). 2009.

6. Eisen J.A., Jospin G., Farra A., Coil D.A., Tokajian S..Whole genome sequencing of extended-spectrum β-lactamase producing Klebsiella pneumoniae isolated from a patient in Lebanon // Front Cell Infect Microbiol. – 2015. – V.8. – P. 5–32.

7. Knothe H., Shah P, Krcmery V, Antal M, Mitsuhashi S. Transferable resistance to cefotaxime, cefoxitin, cefamandole and cefuroxime in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Serratia marcescens //.. Infection. – 1983. – Vol.11. № 6. – P. 315–7.

8. Logan L.K., Braykov N.P., Weinstein R.A., Laxminarayan R. CDC Epicenters Prevention Program. Extended-Spectrum β-Lactamase-Producing and Third-Generation Cephalosporin-Resistant Enterobacteriaceae in Children: Trends in the United States 1999–2011 // J Pediatric Infect Dis Soc. – 2014. – № 3. – P. 320–328.

9. Manoharan A., Premalatha K., Chatterjee S., Mathai D. SARI Study Group. Correlation of TEM, SHV and CTX-M extended-spectrum beta lactamases among Enterobacteriaceae with their in vitro antimicrobial susceptibility // Indian J Med Microbiol. – 2011. – V.29; № 2. – P.161–164.

10. Uzunović S., Ibrahimagić A., Hodžić D., Bedenić B. Molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of AmpC- and/or extended-spectrum (ESBL) ß-lactamaseproducing Proteus spp. clinical isolates in Zenica-Doboj Canton, Bosnia and Herzegovina // Med Glas (Zenica). – 2016. -V.1; №2. – P.103–112.

Бета-лактамные антибиотики (БЛА), в настоящее время являются наиболее широко используемым классом антибактериальных средств для лечения тяжелых инфекционных патологий, включая госпитальные инфекции. Основным фактором, ограничивающим клиническую эффективность БЛА, является способность микроорганизмов вырабатывать гидролитические ферменты бета-лактамазы, разрушающие их структуру и придающие устойчивость бактериям ко многим, а в некоторых случаях ко всем β-лактамным антибиотикам [7]. Прогрессирующее увеличение устойчивости к антибиотикам, опосредованное продукцией β-лактамаз, наблюдается во многих странах и ведет к многочисленным вспышкам инфекций. [2,8].

β-лактамазы расширенного спектра (БЛРС) впервые были выявлены в середине 1980-х, в последние десятилетия устойчивость к БЛА за счет продукции БЛРС достигла масштабов эпидемии [7]. Синтез ферментов БЛРС обеспечивает бактериям устойчивость к β-лактамным препаратам широкого спектра, таким как пенициллины, азтреонам, а также к цефалоспоринам первого, второго и третьего поколения. Гены БЛРС локализуются на хромосомах или на мобильных генетических элементах плазмидах и транспозонах, это является важным драйвером возрастания резистентности в результате горизонтального переноса и клональной экспансии устойчивых штаммов [10].

Наиболее распространенными во всем мире возбудителями инфекций с множественной лекарственной устойчивостью являются бактерии семейства Enterobacteriaceae, преимущественно Klebsiella pneumonia. K. pneumoniae является важным патогеном нозокомиальных инфекций человека и наиболее распространенными грам – отрицательными бактериями с множественной лекарственной устойчивостью во всем мире. БЛРС- продуцирующие K. pneumoniae вызывают инфекции ассоциированные с мочевыводящей системой, желудно-кишечным и респираторным трактом [6].

Появление полирезистентных патогенов в амбулаторных условиях представляет собой серьезную проблему в борьбе с инфекциями и является фактором риска для дальнейшего распространения множественной лекарственной устойчивости к различным классам антибиотиков [8]. Исследования формирования и пространственной локализации антибиотикорезистентности, как многоцентровые, так и локальные являются важнейшим мероприятием по сдерживанию дальнейшего распространения патогенных организмов.

Цель данного исследования заключалась в выявлении БЛРС – продуцирующих штаммов Klebsiellа pneumoniae у амбулаторных пациентов, изучении их чувствительности к антибиотическим препаратам различных групп и распространенности генов бета-лактамаз расширенного спектра blaTEM-1,2, bla CTX-М.

Материалы и методы исследования

Для исследования были отобраны 36 изолятов Klebsiellа pneumoniae, выделенных из различных локусов организма амбулаторных пациентов г. Ростова-на-Дону в период с апреля по октябрь 2015 г. Критерием включения изолятов в исследование было снижение чувствительности хотя бы к одному из β-лактамных антибиотических препаратов до уровня, предлагаемого Национальным комитетом по клиническим лабораторным стандартам США – CLSI [5].

Чувствительность к антибиотическим препаратам определялась диско-диффузионным методом согласно рекомендациям и критериями, изложенным в Методических указаниях по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам [1].

Видовую идентификацию изолятов проводили с использованием тест-систем MIKRO-LA-TEST (PLIVA-Lachema Diagnostika s.r.o., Чехия) и автоматического бактериологического анализатора «VITEK-2 compact» (BioMerieux, Франция).

Для обнаружения генов-маркеров резистентности к пенициллинам blaTEM-1,2 и цефалоспоринам blaСТХ-M изоляты исследовали с помощью ПЦР. Для этого использовали ПЦР наборы ООО НПО “Литех” для обнаружения генетически обусловленной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам формата one step.

ДНК из суточной культуры исследуемых изолятов выделяли с помощью набора «ДНК-экспресс» (ООО НПФ «Литех», г. Москва), согласно инструкции.

ПЦР проводилась в амплификаторе “Терцик“ (ДНК технологии, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Продукты амплификации разделяли методом горизонтального электрофореза в 2 % агарозном геле. Анализ электрофореграмм проводили на трансиллюминаторе GelDoc (BioRad).

Результаты исследования и их обсуждение

Все отобранные для исследования изоляты были протестированы на чувствительность к антибиотикам различных групп: бета – лактамным препаратам пенициллинам (ампициллину, амоксициллину), цефалоспоринам I, II, III, IV поколения (цефазолину, цефуроксиму, цефотаксиму, цефепиму), карбапенемам (имипенему, дорипенему), а также к аминогликозидам (гентамицину) и фторхинолонам (ципрофлоксацину).

Было установлено, что 58.3 % K. pneumoniae устойчивы к цефазолину, цефотаксиму и цефепиму, резистентность к цефуроксиму составила 50 %. у 100 % изолятов зарегистрирована устойчивость к ампициллину, амоксициллину. Все исследованные изоляты оказались чувствительными к имипенему и дорипенему. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Чувствительность изолятов K. pneumoniae к БЛА (n=36)

Среди изолятов был выявлены образцы, обладающие множественной лекарственной устойчивостью не только к БЛА, а также к антибиотикам других групп: гентамицину и ципрофлоксацину – 2 и 3 изолята соответственно.

У части образцов одновременно зарегистрирована полирезистентность к пенициллинам и цефалоспоринам I-IV поколения, т.е. они экспрессируют фенотип БЛРС. Выраженная устойчивость к этим препаратам является следствием наличия у бактерий генов, кодирующих продукцию детерминант устойчивости к БЛА.

В нашем исследовании все изоляты были протестированы на наличие у них генов blaTEM-1,2 bla CTX-М. Результаты анализа генотипов представлены в табл. 2.

Таблица 2

Распределение генов β-лактамаз у K.pneumoniae устойчивых к БЛА

Положительные результаты амплификации blaTEM-1,2 и bla CTX-М зарегистрированы у 11 и 20 исследованных изолятов соответственно, т.о. относительная частота встречаемости bla CTX-М практически в 2 раза выше, чем blaTEM-1,2. при этом у 19.4 % K.pneumoniae обнаружены оба исследуемых гена.

Устойчивость к β-лактамным антибиотикам у бактерий реализуется за счет нескольких механизмов, включая продукцию различных энзимов, изменения конформации пенициллинсвязывающих белков, снижения проницаемости оболочки клетки и активного выведения АБП из микробной клетки (эффлюкса).

В настоящее время внимание исследователей обращено в основном на изучение трех основных групп ферментов бета-лактамаз, относящихся к молекулярному классу а – ТЕМ, SHV и СТХ-М, которые способны расщеплять не только антибиотики пенициллинового ряда и ранние цефалоспорины, но и цефалоспорины III и IV поколений. в каждой из этих гpyпп бета-лактамазы отличаются от основного фермента единичными аминокислотными заменами, которые расширяют спектр их ферментативной активности или приводят к возникновению устойчивости к ингибиторам [4]. у БЛРС-продуцирующих штаммов K. pneumoniae CTX-M является доминирующим, но TEM и SHV ферменты, а также β-лактамазы трех других классов (B, C, D) также детектированы и широко распространены. Резистентность к карбапенемам может ассоциироваться с продукцией карбопенемаз класса A KPCs, класса B металло-β-лактамаз (VIM, IMP, или NDM-1) или класса D OXA-тип энзимов [9].

Большинство субтипов ТЕМ и SHV бета-лактамаз являются БЛРС, способными расщеплять не только антибиотики пенициллинового ряда и ранние цефалоспорины, но и цефалоспорины III и IV поколений. Характерную для БЛРС активность проявляют также все ферменты СТХ-М типа [3].

Результаты анализа фенотипов и генотипов позволили установить, что резистентность к БЛА у 72 % исследованных изолятов ассоцирована с генами β-лактамаз blaTEM-1,2 и bla CTX-М.

В дополнение к БЛРС, устойчивость к бета-лактамам расширенного спектра у Enterobacteriaceae может быть опосредована другими плазмидами и ферментами, закодированными на хромосомах, такими как карбапенемазы и AmpC цефалоспориназы [2]. Многие гены БЛРС располагаются на больших плазмидах, на которых могут также присутствовать детерминанты устойчивости к другим классам антибиотиков к аминогликозидам, тетрациклиамн, сульфаниламидам или фторхинолонам. Это ведет к появлению БЛРС-продуцирующих патогенов с множественной лекарственной устойчивостью. в нашем исследовании также детектированы изоляты, обладающие множественной лекарственной устойчивостью к различным класса антибиотиков: БЛА, аминогликозидам и фторхинолонам.

Заключение

Полученные результаты показывают, что обнаруженная множественная лекарственная устойчивость у амбулаторных изолятов K.pneumoniae связана с производством генов β-лактамаз CTX-M и ТЕМ-1,2 и подтверждают потенциальную роль K.pneumoniae, как резервуара для БЛРС генов и других детерминант резистентности. Наличие патогенов устойчивых к современным антибиотикам не только у госпитализированных, но и у амбулаторных пациентов способствует распространению БЛРС среди здоровых людей, в общественных учреждениях и в окружающей среде.

Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской федерации в рамках базовой части государственного задания в сфере научной деятельности № 1878 «Разработка фундаментальных аспектов молекулярной диагностики и митохондриальной фармакологии».

Библиографическая ссылка