Для исследования биологически активных веществ (БАВ), одним из наиболее удобных и быстрых методов является методика органотипического культивирования различных тканей [9, 10]. С применением этой методики был исследован ряд биорегуляторных пептидов, не обладающих видоспецифичностью, в но в то же время являющихся тканеспецифичными [6, 7]. Биорегуляторные пептиды в настоящее время уже используются в медицинской практике при многих заболеваниях нервной, иммунной, эндокринной систем, при патологии различных органов [3, 9]. Одним из научно обоснованных методов повышения продолжительности и качества жизни также является применение пептидных биорегуляторов. Пептидные биорегуляторные препараты в течение 1980–2015 гг. получили более 15 млн человек с различной патологией или в качестве средств профилактики, и в рандомизированном сравнительном исследовании установлено снижение темпа старения организма и смертности [9].
В настоящее время фармацевтическая компания ООО «Самсон-Мед» производит субстанцию и лекарственный препарат «Сампрост® лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения 5 мг», который представляет собой комплекс биологически активных пептидов предстательной железы, а ФГУП «НПО «Микроген» производит лекарственный препарат «Простакор раствор для внутримышечного введения, 5 мг/мл». Препараты получают из предстательной железы крупного рогатого скота и используют для лечения простатита. «Тималин лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения» производства ООО «Самсон-Мед» и «Тактивин® раствор для подкожного введения 0,1 мг/мл» производства АО «Биомед» им. И.И. Мечникова являются иммуномодулирующими препаратами, их получают из тканей тимуса (вилочковой железы) крупного рогатого скота. Актуальной является проблема быстрого тестирования биологической активности и специфичности действия этих препаратов. Метод реактивации щелочной фосфатазы, ингибированной цистеином, а также метод «активного розеткообразования» тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика отражают каждый только один из многих биохимических процессов в организме. В то же время органотипическое культивирование сразу показывает воздействие пептидов на основные клеточные процессы – пролиферацию или апоптоз (программированная клеточная гибель) в соответствующей ткани. Т.е. при культивировании максимально воспроизводятся те условия, которые происходят в тканях организма под действием биорегуляторных пептидов, с учетом усиления клеточной регенерации. Таким образом, наиболее адекватным методом для быстрой количественной оценки направленности влияния исследуемых БАВ является органотипическое культивирование фрагментов тканей [1, 2, 7, 8]. Этот быстрый (в течение 3 суток) скрининговый метод позволяет проанализировать усиление или угнетение клеточной регенерации при воздействии того или иного биологически активного вещества, а также лекарственного препарата. К преимуществам этого метода относится также то, что в фрагментах культивируемой ткани сохраняется ее структурная организация.
Целью работы было исследование биологической активности и специфичности действия вышеуказанных препаратов с использованием метода органотипического культивирования различных тканей крыс.
Материалы и методы исследования
В опытах органотипического культивирования использованы половозрелые крысы линии Вистар, массой 250–300 г. Фрагменты селезенки либо предстательной железы самцов крыс величиной 1 мм3 размещались в чашках Петри (с полилизиновым покрытием дна). В питательную среду добавляли по 35 % среды Игла и раствора Хенкса, а также фетальную сыворотку быка, глюкозу (0,6 %), гентамицин (100ед/мл). Для определения эффективных концентраций лекарственные препараты добавляли в питательную среду экспериментальных чашек Петри в концентрациях 1–50 нг/мл. Эксплантаты тканей в чашках Петри культивировались в термостате с подачей 5 % СО2. при температуре 37 °С. В 1-е сутки культивирования происходило выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток, образующих зону роста эксплантата. Оценку влияния препаратов на развитие эксплантатов производили морфометрическим методом, используя критерий индекса площади (ИП). ИП являлся отношение площади всего эксплантата, вместе с периферической зоной роста, к площади центральной зоны. В каждой чашке Петри считали ИП у каждого из 15–18 эксплантатов, складывали значения и делили на число эксплантатов, т.е. получали средний ИП для данной чашки. Контрольное значение ИП принимали за 100 %, все остальные ИП выражали в процентах к контролю. Достоверность различий сравниваемых средних значений ИП контрольных и опытных образцов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Статистическую обработку полученных данных производили с использованием пакета программ «Microsoft Excel».
Результаты исследования и их обсуждение
В табл. 1 представлены результаты тестирования влияния ряда биорегуляторных пептидов, выделенных из предстательной железы крупного рогатого скота, на увеличение индекса площади ( %) эксплантатов предстательной железы линейных крыс Вистар. Так при культивировании фрагментов ткани выявлено, что лекарственный препарат «Сампрост® лиофилизат» серии 10214 в концентрациях 20 и 50 нг/мл приводил к статистически достоверному увеличению ИП эксплантатов на 22 ± 3 % (n = 21, p < 0,05) и на 47 ± 5 % (n = 19, p < 0,05) соответственно, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n = 18). Препарат «Простакор®» приводил к статистически достоверному увеличению ИП эксплантатов на 20 ± 3 % (n = 20, p < 0,05), по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n = 19) только при концентрации 50 нг/мл. Таким образом, препарат Сампрост обладал более широким диапазоном действия, эффективно стимулируя зону роста предстательной железы при концентрациях 20 и 50 нг/мл.
Таблица 1
Влияние биорегуляторных пептидов на увеличение индекса площади ( %) эксплантатов предстательной железы
Наименование препарата |
Номер серии |
Производитель |
Концентрация препарата |
|
20 нг/мл |
50 нг/мл |
|||
«Сампрост® лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения 5 мг» |
90116 (производственная серия лиофилизата) |
ООО «Самсон-Мед» |
20* |
22* |
10214 (производственная серия лиофилизата) |
22* |
47* |
||
940816 (производственная серия лиофилизата) |
24* |
22* |
||
«Простакор раствор для внутримышечного введения, 5мг/мл» |
УП 10616 |
Микроген НПО |
5 |
20* |
Примечание. * р < 0,05 по сравнению с показателем в контроле.
Таблица 2
Влияние биорегуляторных пептидов на увеличение индекса площади ( %) эксплантатов селезенки
Наименование препарата |
Номер серии |
Производитель |
Концентрация препарата |
|
20 нг/мл |
50 нг/мл |
|||
«Тималин лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения» |
14 (опытный лиофилизат, соответствует условиям производства) |
ООО «Самсон-Мед» |
12 |
35* |
121016 (производственная серия лиофилизата,) |
22* |
19 |
||
«Тактивин® раствор для подкожного введения 0,1 мг/мл» |
0110117 |
АО «Биомед» им. И.И. Мечникова |
4 |
20* |
Примечание. * р < 0,05 по сравнению с показателем в контроле.
В табл. 2 представлены результаты тестирования влияния ряда биорегуляторных пептидов, выделенных из вилочковой железы крупного рогатого скота, на увеличение индекса площади ( %) эксплантатов на иммунную ткань селезенки линейных крыс Вистар. При культивировании фрагментов ткани выявлено, что препарат Тималин серии 14 в концентрации 50 нг/мл к статистически достоверному увеличению ИП эксплантатов на 35 ± 5 % (n = 20, p < 0,05) соответственно, по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n = 21). Препарат Тактивин приводил к увеличению ИП эксплантатов лишь на 20 ± 1 % (n = 18, p < 0,05), по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n = 19) при концентрации 50 нг/мл.
В следующих сериях опытов для выявления тканеспецифического действия биорегуляторных пептидов использовался пептидный препарат Кортексин, обладающий тропностью к тканям нервной системы [3, 4]. Эксперименты заключались в том, что, например, Тималин серии 121016 в эффективной концентрации вводился в чашки Петри с эксплантатами селезенки и в другие чашки с эксплантатами коры головного мозга крыс. Аналогичным образом вводился Кортексин в эффективных концентрациях как в чашки с эксплантатами коры, так и в чашки с эксплантатами селезенки. Найдено, что Тималин 121016 увеличивал ИП эксплантатов селезенки на 27 ± 5 % (n = 18, p < 0,05), по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n = 20) и не оказывал влияния на эксплантаты коры головного мозга – ИП оставался на уровне контроля (табл. 3). В то же время Кортексин увеличивал значения ИП эксплантатов коры головного мозга на 20 ± 3 % (n = 17, p < 0,05), по сравнению с ИП контрольных эксплантатов (n = 18), а при действии на эксплантаты селезенки значения ИП оставались на уровне контрольных эксплантатов.
Таблица 3
Индекс площади ( %) при действии эффективных концентраций Тималина серии 21 (50 нг / мл) и Кортексина (20нг / мл) на эксплантаты селезенки и коры головного мозга
Наименование ткани |
Наименование препарата |
|
Тималин, серия 121016 |
Кортексин |
|
Селезенка |
22* |
-4 |
Кора головного мозга |
5 |
20* |
Примечание. * р < 0,05 по сравнению с показателем в контроле.
Аналогичным образом подтверждено тканеспецифическое действие остальных исследованных биорегуляторных пептидов в отношении тканей предстательной железы и селезенки. Таким образом, используемый для идентификации и характеристики биорегуляторных пептидов скрининговый метод органотипического культивирования тканей относительно прост и позволяет быстро получить экспериментальные данные, необходимые для статистической обработки. Можно полагать, что метод органотипического культивирования тканей для определения активности биорегуляторных пептидов имеет ряд преимуществ по сравнению с такими методами, как реакция «активного» розеткообразования (РОК) для исследования препаратов из тимуса или реактивация щелочной фосфатазы, ингибированной цистеином, для исследования препаратов из предстательной железы. Указанные методы представляют многоступенчатые трудоемкие исследования с использованием большого количества химических реактивов. Для метода РОК требуется значительное количество дорогостоящих животных – морских свинок. Данные, полученные в настоящей работе методом органотипического культивирования тканей свидетельствуют о биологической активности и специфичности действия препаратов «Сампрост®», «Простакор®», «Тималин», «Тактивин®». Биологическая активность биорегуляторных пептидов может быть объяснена на молекулярном уровне следующим образом [7, 8]. Олигопептиды способны проникать в клетку через цитоплазму и мембрану ядра [5]. Комплементарное взаимодействие этих пептидов с промоторными зонами генов является сигналом для транскрипции, трансляции и синтеза белков на рибосомах. Цепь этих процессов приводит к повышению функций различных органов и увеличивает ресурс организма.
Заключение
Полученные в данной работе результаты показывают, что использование органотипической культуры ткани, представляющей сравнительно простую модельную систему, позволяет быстро тестировать биологическую активность и специфичность действия биорегуляторных пептидов. Это в свою очередь способствует успешному решению многих проблем фармакологии в области биорегуляторных пептидов.
Библиографическая ссылка
Чалисова Н.И., Мельникова Я.В., Заломаева Е.С. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДНЫХ БИОРЕГУЛЯТОРОВ В ОРГАНОТИПИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2017. – № 6-2. – С. 274-277;URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=11667 (дата обращения: 17.08.2024).