Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,570

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА SP-ПОЗИТИВНЫХ СТРУКТУР ТИМУСА ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС ПРИ ПОЛУЧЕНИИ КАЛЬЦИЯ С ПИТЬЕВОЙ ВОДОЙ

Дьячкова И.М. 1 Сергеева В.Е. 1
1 ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»
Проведено исследование длительного поступления кальция с питьевой водой на структуры тимуса лабораторных крыс. С помощью иммуногистохимических и статистических методов исследованы SP-позитивные структуры тимуса 80 лабораторных крыс. Морфологические изменения тимуса свидетельствуют об избирательном характере действия солей кальция на SP-позитивные структуры. Выявлено, что длительное поступление кальция с питьевой водой (235 мг/л в течение 60 дней) приводит к увеличению количества SP-позитивных клеток в корковом веществе и на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса, к уменьшению размера и площади исследуемых клеток в корковом веществе долек. Анализ полученных данных показал, что поступление в организм лабораторных крыс с питьевой водой соединения кальция повышает экспрессию SP-рецепторов клетками тимуса. Наши результаты исследования показали адаптационные изменения структур долек тимуса на поступление соли кальция и усиление пролиферации и дифференцировки тимоцитов. Выявленные морфологические изменения SP-позитивных клеток отражают проявление адаптационных реакций тимуса на действие солей кальция.
тимус
кальций
SP-позитивные клетки
1. Артемьева И.Л., Сергеева В.Е. Морфофункциональная характеристика структур тимуса при экспериментальной тестэктомии. – Чебоксары: Изд-во Чуваш. ун-та, 2012. – 96 с.
2. Дьячкова И.М. Некоторые адаптационные реакции тимуса на поступление кальция и кремния / И.М. Дьячкова, В.С. Гордова, В.Е. Сергеева, С.П. Сапожников. – Чебоксары: Изд-во Чуваш. ун-та, 2014. – 140 с.
3. Искендеров Б.Г. Артериальная гипертензия и метаболизм кальция: Монография. – Пенза, 2010. – 224 с.
4. Николаева Т.И., Сперанский А.М., Сергеева В.Е. Влияние кальция на гистаминосодержащие структуры пейеровых бляшек // Современные проблемы химии и защиты окружающей среды. – Чебоксары: ЗАО «Порядок», 2007. – С. 109.
5. Семенков В.Ф., Карандашов В.И., Михайлова Т.А. Стресс и старение человека // Вестник академии естественных наук. – 2011. – № 4. – С. 72–78.
6. Сокол А.В. Исследование иммунореактивности к кальцитонин ген-родственному пептиду в тимусе человека // Новые технологии в медицине. – 2010. – С. 116–120.
7. Соколова И.С., Дьячкова И.М., Сергеева В.Е., Сапожников С.П. Морфометрические изменения структур тимуса при экспериментальном хроническом введении кальция // Наука и инновации-2010 ISS «SI-2010»: мат. V междун. научн. школы. – Йошкар-Ола, 2010. – С. 298–302.
8. Kendall M.D., Al-Shawaf A.A. Innervation of the rat thymus gland // Brain, Behavior, Immunity. – 1991. – № 5. – P. 9–28.
9. Lorton D., Bellinger D.L., Felten S.Y., Felten D.L. Substance P Innervation of the rat thymus // Peptides. – 1990. – № 11. – P. 1269–1275.
10. Piotrowski W. Action of the SP2-11 and SP3-11 fragments of substance P on rat peritoneal mast cells // Agents Actions. – 1987. – Vol. 20. – P. 178–180.
11. Silva А.В., Aw D., Palmer D.B. Functional analysis of neuropeptides in avian thymocyte development // 1.Immunol. – 2008. – № 32. – P. 410–420.

Известно, что ионизированный кальций играет важную роль в жизнедеятельности организма. Кальций посредством кальцийзависимого белка кальмодулина регулирует разнообразные биологические процессы: секрецию инсулина, тиреоидных гормонов, гормонов надпочечников, кишечной секреции, лизосомных ферментов [3], участвует в высвобождении нейромедиаторов, клеточной пролиферации [7, 2], в синтезе простагландинов, распаде микротрубочек, лейкоцитарном фагоцитозе. Он занимает важнейшее место в функционировании центральных и периферических нейронов [3].

Ионы кальция также необходимы для нормального функционирования лимфоидной ткани. Выявлено, что гипокальциемия угнетает митотическую активность лимфоидной ткани, а гиперкальциемия, наоборот, стимулирует эту митотическую активность. В норме после нескольких циклов пролиферации лимфоцитов обычно происходит их дифференцировка, которая в целом рассматривается как процесс альтернативной пролиферации [4].

В тимусе выявлены и описаны нервные волокна, содержащие нейропептиды: вазоактивный интестинальный пептид, родственный кальцитонину [6], нейропептид Y, субстанция Р [9, 11]. В кортикомедуллярной зоне выявлены ВИП-содержащие и нейропептид SP-позитивные клетки [1]. В соединительной ткани капсулы и септ тимуса были идентифицированы SP-содержащие нервные волокна [8], которые находились в тесном контакте с тучными клетками [10]. Известны функциональные рецепторы SP на поверхности лимфоцитов, макрофагов, тучных клеток [9]. Макрофаги различных видов животных и человека имеют рецепторы для субстанции Р, которые секретируют ИЛ-1, -6, ФНОα и ПГЕ² [5].

В организме наблюдается взаимодействие эндокринной, нервной и иммунной систем. Примером такого взаимодействия нервной и иммунной систем служит влияние нейропептида – субстанции Р – на функцию макрофагов. Субстанция Р содержит 11 аминокислотных остатков, относится к семейству биоактивных пептидов или тахикининам и встречается повсеместно в центральной и периферической нервной системе [5].

Субстанция Р обладает весьма широким спектром биологической активности. Оказывает сосудорасширяющее действие, влияет на артериальное давление крови, способствует дегрануляции тучных клеток, активирует синтез и высвобождение медиаторов воспаления, увеличивает капиллярную проницаемость, является хемоаттрактантом для лейкоцитов, вызывает сокращение гладкой мускулатуры, оказывает секретогенное действие, стимулирует высвобождение пролактина [1].

В современной литературе нет данных о SP-позитивных структурах тимуса лабораторных крыс при поступлении в организм хлорида кальция с питьевой водой. Необходима морфологическая оценка нейропептидсодержащих клеток тимуса, для оценки адаптации тимуса на длительное введение кальция с питьевой водой.

Цель исследования – изучение морфологических и количественных изменений SP-позитивных структур тимуса лабораторных крыс при поступлении в организм хлорида кальция с питьевой водой.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования явился тимус 80 белых нелинейных беспородных лабораторных крыс-самцов одного возраста и одинаковой массы (150–200 г), содержавшихся в обычных условиях при естественном освещении и сбалансированном рационе питания.

Все действия, предусматривавшие контакты с экспериментальными животными, осуществлялись согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» и в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.13.1986 г.

Животные были разделены на 2 группы: первая группа – интактные (контрольные) – 40 особей, которые получали питьевую воду соответствующую требованиям ГОСТ Р 51309-99, ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4. 1116-02; вторая, или опытная, состояла из 40 особей животных, которые употребляли питьевую воду соответствующую требованиям ГОСТ Р 51309-99, ГОСТ Р 52109-2003, СанПиН 2.1.4. 1116-02 с добавлением кальция 235 мг/л (вода+CaCl2). В среднем в течение суток опытные животные получали с питьевой водой 8,1–10,2 мг/кг кальция. Эксперимент длился два месяца. Выведение животных из эксперимента проводилось путем декапитации с соблюдением требований гуманности согласно правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных «О порядке проведения эвтаназии животного» (Приказ МЗ РФ № 708н от 23.08.2010 г.).

Криостатные срезы тимуса толщиной 10 мкм обрабатывались непрямым иммуногистохимическим методом. Блок неспецифического связывания проводился преинкубацией срезов с 10 % козьей сывороткой и 0,05 % тритоном Х-100. В качестве первичных антител были использованы кроличьи поликлональные антитела против рецепторов вещества Р (rabbit polyclonal anti-Substance P receptor, 1:5000, Affnnity BioReagents, Inc, USA), вторичных антител – меченные биотилином кроличьи антитела (1:1000, goat anti-rabbit Ig G, Vector Laboratories). Для визуализации позитивного окрашивания срезы инкубировались с авидин-биотиновым комплексом (Vector Laboratories) и диамино-бензоидином. Последний дает коричневую окраску детектированным SP-позитивным структурам.

Морфометрический анализ включал определение размеров клеточных структур тимуса микроскопом МИКМЕД-5 (при увеличении объектива 40 и окуляра 10), находящихся в десяти полях зрения размером 0,04 мм2. Расчет площадей клеток производился с использованием программы «Sigma Scan Pro 5.0». О количественном распределении клеток судили по подсчету их в 10 полях зрения.

Статистический анализ полученных цифровых данных проводился с помощью программы Microsoft Office Excel с оценкой достоверности различия средних величин по t-критерию Стьюдента. Вычислялись: М – среднеарифметическая величина, σ – стандартная ошибка среднего значения, p – достоверность различия показателей подопытных групп по сравнению с контрольной группой: * – p ≤ 0,05; ** – p ≤ 0,01.

Результаты исследования и их обсуждение

У интактных животных с помощью иммуногистохимической реакции в дольках тимуса выявляются SP-позитивные структуры. SP-позитивные клетки темно-коричневой окраски четко определяются на светло-коричневом фоне лимфоидной ткани железы во всех морфофункциональных зонах. Размеры и количество SP-позитивных клеток тимуса лабораторных животных в морфо-функциональных зонах различны (рис. 1).

djchk1.tif

Рис. 1. SP-позитивные клетки на границе коркового и мозгового вещества тимуса животных контрольной группы. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10

djchk2.tif

Рис. 2. Долька тимуса животных опытной группы. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40. Ок. 10. SP-позитивные тучные клетки

В субкапсулярной зоне долек железы выявляются крупные SP-позитивные клетки, по размерам и морфологическим признакам соответствуют тучным клеткам тимуса [2] (рис. 2). D. Lorton et. al., 1990 г. [9] впервые выявлены SP-рецепторы на поверхности лимфоцитов, макрофагов, тучных клеток.

Длительный прием соли кальция с водой приводит к увеличению количества SP-позитивных клеток в 1,4 раза в корковом веществе (в контроле – 57, в опыте – 80 клеток в десяти полях зрения) в 1,1 раза на границе коркового и мозгового вещества ( в контроле – 66, в опыте – 73 клеток в десяти полях зрения) и уменьшению в 1,1 раза – в мозговом веществе долек тимуса (в контроле – 65, в опыте – 56 клеток в десяти полях зрения).

Производились измерения двух диаметров всех SP-позитивных клеток, находящихся в десяти полях зрения размером 0,04 мм2. Затем методом сигмальных отклонений рассчитывались объем и площадь клеток, определялись пределы размеров малых, средних, крупных клеток. Расчет показал, что площадь малых клеток в корковом веществе тимуса животных контрольной группы составляет 23,7 до 57,5 мкм2, средних – 57,6–149,3 мкм2, больших – от 149,4 мкм2 и более. В мозговом веществе долек площадь малых клеток находилась в пределах 30,3–52,7 мкм2, средних – 52,8–139,5 мкм2, больших – от 139,6 мкм2, на границе коркового и мозгового вещества площадь малых клеток находилась в пределах от 36,7 до 54,7 мкм2, средних –54,8–134,0 мкм2, больших – от 134,1 мкм2. Так как, размер SP-позитивных клеток варьирует от 23,7 до 149,4 мкм2, можно предположить, что это могут быть как макрофаги, так и лимфоциты [9, 11].

При оценке морфологии SP-позитивных клеток тимуса животных опытной группы уменьшалось количество мелких и увеличивалось число средних клеток в мозговом, корковом веществе долек тимуса и на границе между корковым и мозговым веществом, 69,7 %, 76,3 % и 74,0 % соответственно при 66,2 %, 52,6 % и 57,6 % в контроле (табл. 1, 2, 3). Таким образом, длительное поступление солей кальция с питьевой водой приводит к уменьшению лимфоцитов SP рецепторами и увеличению SP-позитивных макрофагов во всех структурах долек тимуса.

Таблица 1

Распределение SP-позитивных клеток в корковом веществе долек тимуса с учетом их размеров (в мкм2) (контрольных и опытных животных)

Группа

животных

Размер

клеток

контрольная

опытная

маленькие:

23,7–57,5

15 (26,3 %)

14 (17,5 %)

средние:

57,6–149,3

30 (52,6 %)

61 (76,3 %)

большие:

149,4 и более

12 (21,1 %)

5 (6,2 %)

Всего клеток:

57

80

Таблица 2

Распределение SP-позитивных клеток в мозговом веществе долек тимуса с учетом их размеров (в мкм2) (контрольных и опытных животных)

Группа

животных

Размер

клеток

контрольная

опытная

маленькие:

30,3–52,7

14 (21,5 %)

5 (8,9 %)

средние:

52,8–139,5

43 (66,2 %)

39 (69,7 %)

большие:

139,6 и более

8 (12,3 %)

12 (21,4 %)

Всего клеток:

65

56

Таблица 3

Распределение SP-позитивных клеток на границе между корковым и мозговым веществом долек тимуса с учетом их размеров (в мкм2) (контрольных и опытных животных)

Группа

животных

Размер

клеток

контрольная

опытная

маленькие:

36,7–54,7

15 (22,7 %)

10 (13,7 %)

средние:

54,8–134,0

38 (57,6 %)

54 (74,0 %)

большие:

134,1 и более

13 (19,7 %)

9 (12,3 %)

Всего клеток:

66

73

Увеличение средних размеров клеток отразилось и на среднем диаметре SP-позитивных клеток. У животных опытной группы на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса площадь клеток достоверно (p < 0,01) превышала таковую у контрольных животных. В корковом веществе долек тимуса, наблюдается обратная картина, площадь клеток достоверно (p < 0,01) уменьшается с 105,18 ± 9,23 мм2 до 88,09 ± 4,85 мм2 (табл. 4).

Таблица 4

Площади SP-позитивных клеток в дольках тимуса экспериментальных животных (М ± σ мкм2)

Морфофункциональная зона

Группа

животных

Корковое вещество долек

Мозговое вещество долек

Граница коркового и мозгового вещества долек

контрольная

105,18 ± 9,23

101,43 ± 8,43

82,85 ± 4,31

опытная

88,09 ± 4,85*

115,61 ± 7,65

103,86 ± 5,89*

Примечание. * – различия достоверны с контрольной группой (p < 0,01).

Анализ полученных данных показал, что поступление в организм лабораторных крыс с питьевой водой соединения кальция повышает экспрессию SP-рецепторов клетками тимуса. Об этом свидетельствует увеличение площади SP-позитивных клеток как в мозговом веществе, так и на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. В научной литературе имеются данные об участии SP в процессах пролиферации и дифференцировки развивающихся тимоцитов, тучных клеток и других иммунокомпетентных клеток тимуса [1]. Наши результаты исследования показали адаптационные изменения структур долек тимуса на поступление соли кальция и усиление пролиферации и дифференцировки тимоцитов.

Выводы

1. В корковом веществе долек тимуса опытной группы лабораторных крыс происходит значительное увеличение численного состава SP-позитивных клеток, вместе с тем наблюдается уменьшение их площади и объема.

2. На границе коркового и мозгового вещества долек тимуса лабораторных животных наблюдаются увеличение количества SP-позитивных клеток, укрупнение их размера и объема.


Библиографическая ссылка

Дьячкова И.М., Сергеева В.Е. МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА SP-ПОЗИТИВНЫХ СТРУКТУР ТИМУСА ЛАБОРАТОРНЫХ КРЫС ПРИ ПОЛУЧЕНИИ КАЛЬЦИЯ С ПИТЬЕВОЙ ВОДОЙ // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2017. – № 10-2. – С. 241-245;
URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=11896 (дата обращения: 23.09.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074