Научный журнал

Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Савинова Е.А. 1 Каменева Л.В. 1 Ершова Е.С. 1 Умрюхин П.Е. 1, 2 Родионов И.В. 1, 2 Артюшин А.А. 1 Краевая О.А. 3 Трошин П.А. 3, 4 Вейко Н.Н. 1 Костюк С.В. 1

---

1 ФГБУН «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

2 ФГБОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

3 ФГБУН «Институт проблем химической физики» Российской академии наук

4 Силезский технологический университет

Сателлитная ДНК – характерный компонент генома эукариотических клеток, состоящий из тандемно организованных повторов нуклеотидных последовательностей. Сателлитная ДНК не кодирует белки и локализована в конститутивном гетерохроматине хромосом. Сателлитная ДНК характерна для теломерных и центромерных областей хромосом. Транскрипция сателлита III и увеличение числа копий сателлита III в геноме существенно возрастают при репликативном и стресс-индуцированном старении клеток человека, наряду с увеличением уровня окислительного стресса в клетках организма. При этом клетки с большим содержанием сателлита III не отвечают на пролиферативные и иные стимулы, что значительно уменьшает жизнеспособность всей популяции стареющих клеток. В результате проведенных экспериментов в настоящем исследовании было показано, что водорастворимое производное фуллерена С70 снижает уровень транскрипции сателлита III (1q12), а также число клеток с высоким содержанием сателлита III в стареющих культивируемых фибробластах кожи (human skin fibroblasts, HSF) с высоким уровнем активных форм кислорода (АФК). Таким образом, рассматриваемое водорастворимое производное фуллерена С70 может быть рекомендовано к использованию в качестве потенциального агента, способного снижать скорость пролиферативного старения клеточных популяций, характеризующихся высоким уровнем окислительного стресса.

Статья в формате PDF

586 KB

сателлит III

транскрипция сателлита III

фуллерены

старение

1. Feliciello I., Pezer Ž., Sermek A., Mađarić B.B., Ljubić S., Ugarković Đ. Satellite DNA-Mediated Gene Expression Regulation: Physiological and Evolutionary Implication. Prog Mol Subcell Biol. 2021. Vol. 60. P. 145–167.

2. Enukashvily N.I., Ponomartsev N.V. Mammalian satellite DNA: A speaking dumb. Adv. Protein Chem. Struct. Biol. 2013. Vol. 90. P. 31–65.

3. Bersani F., Lee E., Kharchenko P.V., Xu A.W., Liu M., Xega K., MacKenzie O.C., Brannigan B.W., Wittner B.S., Jung H., Ramaswamy S., Park P.J., Maheswaran S., Ting D.T., Haber D.A. Pericentromeric satellite repeat expansions through RNA-derived DNA intermediates in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2015. Vol. 112. P. 15148–15153. DOI: 10.1073/pnas.1518008112.

4. Ershova E.S., Malinovskaya E.M., Konkova M.S., Veyko R.V., Umriukhin P.E., Martynov A.V., Kutsev S.I., Veiko N.N., Kostyuk S.V. Copy number variation of human satellite III (1q12) with aging. Front. Genet. 2019c. 10:704. DOI: 10.3389/fgene.2019.00704.

5. Ershova E.S., Sergeeva V., Chausheva A.I., Zheglo D.G., Nikitina V., Smirnova T.D., Kameneva L.V., Porokhovnik L.N., Kutsev S.I., Troshin P.A., Voronov I.I., Khakina E.A., Veiko N.N., Kostyuk S.V. Toxic and DNA damaging effects of a functionalized fullerene in human embryonic lung fibroblasts. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagenesis. 2016. Vol. 805. Р. 46–57.

6. Enukashvily N.I., Donev R., Waisertreiger I.S., Podgornaya O.I. Human chromosome 1 satellite 3 DNA is decondensed, demethylated and transcribed in senescent cells and in A431 epithelial carcinoma cells. Cytogenet. Genome. Res. 2007. Vol. 118. Р. 42–54. DOI: 10.1159/000106440.

7. Kraevaya O.A., Peregudov A.S., Godovikov I.A., Schurik E.V., Martynenko V.M., Shestakov A.F., Balzarini J., Schols D., Troshin P.A. Direct arylation of C60Cl6 and C70Cl8 with carboxylic acids: a synthetic avenue to water-soluble fullerene derivatives with promising antiviral activity. Chem. Commun. 2020. Vol. 56. Р. 1179–1182.

8. Kovel E.S., Kicheeva A.G., Vnukova N.G., Churilov G.N., Stepin E.A., Kudryasheva N.S. Toxicity and Antioxidant Activity of Fullerenol C 60,70 with Low Number of Oxygen Substituents. Int J Mol Sci. 2021. 15; 22(12): 6382.

9. Valgardsdottir R., Chiodi I., Giordano M., Rossi A., Bazzini S., Ghigna C., Riva S., Biamonti G. Transcription of Satellite III non-coding RNAs is a general stress response in human cells. Nucleic Acids Res. 2008. Vol. 36. Р. 423–434. DOI: 10.1093/nar/gkm1056.

Полиморфные сателлитные тандемные повторы генома человека входят в состав гетерохроматина прицентромерных и центромерных областей хромосом. Фракция сателлитных повторов, которая была обозначена как сателлит III (SatIII), локализована преимущественно в прицентромерном гетерохроматине нескольких хромосом. В ряде работ была описана транскрипция SatIII в клетках человека [1, 2]. Транскрипция сателлита является компонентом адаптивного ответа клетки на стресс. Однако транскрипция SatIII и последующая трансформация РНКSatIII в ДНКSatIII, благодаря активности обратной транскриптазы, может приводить к увеличению размера гетерохроматинового блока SatIII [3]. Клетки с очень большим размером блока прицентромерного гетерохроматина не имеют возможности для развития адаптивного ответа и не делятся. Количество таких клеток возрастает при старении и в условиях хронического окислительного стресса [4]. Можно предположить, что снижение уровня активных форм кислорода (АФК) приведет к снижению активности транскрипции SatIII в стареющих клетках. Показано, что фуллерены С60 и С70 связывают в больших количествах АФК. В работе мы исследовали влияние водорастворимой формы фуллерена С70 на транскрипцию субфракции сателлита III в составе прицентромерного гетерохроматина первой и девятой хромосом.

Материалы и методы исследования

Водорастворимое производное фуллерена С70 (F) (рисунок, А) было синтезировано и охарактеризовано в Институте проблем химической физики РАН [5]. Четыре клеточные линии фибробластов кожи взрослых людей были отобраны из коллекции МГНЦ. Клетки (15–20 пассаж) культивировали в стандартных условиях в присутствии 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (PAA Laboratories, Австрия) в СО2 инкубаторе при 37 °С. Фуллерен в нетоксичной концентрации 10 мкМ добавляли к клеткам на 24 ч.

МТТ–тест. Тест проводили по стандартной методике, используя реагент МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) фирмы Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) и прибор «EnSpire plate reader» (EnSpire Equipment, Turku, Finland).

РТ-ПЦР. РНК клеток выделяли с использованием набора «RNeasy Mini Kit» (Qiagen, ФРГ). РНК обработали ДНКзой 1 и провели обратную транскрипцию, применив «Reverse Transcriptase Kit» (Силекс, РФ). Амплификацию проводили с использованием набора «SYBRgreen PCR MasterMix» и прибора «StepOne Plus» (Applied Biosystems). Были использованы праймеры фирмы Силекс, РФ. В качестве стандарта применили ген TBP. Структура праймеров приводится в работе [4].

NQH (количественная нерадиоактивная гибридизация). Метод подробно описан в предыдущей работе и использовался без изменений [4]. В качестве ДНК-зонда на SatIII использовали плазмиду bio-pUC1.77, которую метили биотином методом ник-трансляции с помощью набора фирмы Силекс, РФ. ДНК из клеток для проведения гибридизации выделяли стандартным методом с использованием экстракции органическими растворителями [4]. Клетки лизировали в присутствии 1 % саркозилата натрия и 0,02 М ЭДТА, лизат обрабатывали последовательно РНКзой А и протеиназой К. После экстракции фенолом и фенол-хлороформом, ДНК водной фазы осаждали 70 % этанолом в присутствии 0,1 М ацетата натрия. Концентрацию ДНК определяли в комплексе с ДНК-связывающимся флуоресцентным красителем PicoGreen (Molecular Probes/Invitrogen, CA, USA).

Определение АФК

Использовали планшетный ридер (EnSpire Equipment, Finland),

Библиографическая ссылка