Полиморфные сателлитные тандемные повторы генома человека входят в состав гетерохроматина прицентромерных и центромерных областей хромосом. Фракция сателлитных повторов, которая была обозначена как сателлит III (SatIII), локализована преимущественно в прицентромерном гетерохроматине нескольких хромосом. В ряде работ была описана транскрипция SatIII в клетках человека [1, 2]. Транскрипция сателлита является компонентом адаптивного ответа клетки на стресс. Однако транскрипция SatIII и последующая трансформация РНКSatIII в ДНКSatIII, благодаря активности обратной транскриптазы, может приводить к увеличению размера гетерохроматинового блока SatIII [3]. Клетки с очень большим размером блока прицентромерного гетерохроматина не имеют возможности для развития адаптивного ответа и не делятся. Количество таких клеток возрастает при старении и в условиях хронического окислительного стресса [4]. Можно предположить, что снижение уровня активных форм кислорода (АФК) приведет к снижению активности транскрипции SatIII в стареющих клетках. Показано, что фуллерены С60 и С70 связывают в больших количествах АФК. В работе мы исследовали влияние водорастворимой формы фуллерена С70 на транскрипцию субфракции сателлита III в составе прицентромерного гетерохроматина первой и девятой хромосом.
Материалы и методы исследования
Водорастворимое производное фуллерена С70 (F) (рисунок, А) было синтезировано и охарактеризовано в Институте проблем химической физики РАН [5]. Четыре клеточные линии фибробластов кожи взрослых людей были отобраны из коллекции МГНЦ. Клетки (15–20 пассаж) культивировали в стандартных условиях в присутствии 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (PAA Laboratories, Австрия) в СО2 инкубаторе при 37 °С. Фуллерен в нетоксичной концентрации 10 мкМ добавляли к клеткам на 24 ч.
МТТ–тест. Тест проводили по стандартной методике, используя реагент МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) фирмы Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) и прибор «EnSpire plate reader» (EnSpire Equipment, Turku, Finland).
РТ-ПЦР. РНК клеток выделяли с использованием набора «RNeasy Mini Kit» (Qiagen, ФРГ). РНК обработали ДНКзой 1 и провели обратную транскрипцию, применив «Reverse Transcriptase Kit» (Силекс, РФ). Амплификацию проводили с использованием набора «SYBRgreen PCR MasterMix» и прибора «StepOne Plus» (Applied Biosystems). Были использованы праймеры фирмы Силекс, РФ. В качестве стандарта применили ген TBP. Структура праймеров приводится в работе [4].
NQH (количественная нерадиоактивная гибридизация). Метод подробно описан в предыдущей работе и использовался без изменений [4]. В качестве ДНК-зонда на SatIII использовали плазмиду bio-pUC1.77, которую метили биотином методом ник-трансляции с помощью набора фирмы Силекс, РФ. ДНК из клеток для проведения гибридизации выделяли стандартным методом с использованием экстракции органическими растворителями [4]. Клетки лизировали в присутствии 1 % саркозилата натрия и 0,02 М ЭДТА, лизат обрабатывали последовательно РНКзой А и протеиназой К. После экстракции фенолом и фенол-хлороформом, ДНК водной фазы осаждали 70 % этанолом в присутствии 0,1 М ацетата натрия. Концентрацию ДНК определяли в комплексе с ДНК-связывающимся флуоресцентным красителем PicoGreen (Molecular Probes/Invitrogen, CA, USA).
Определение АФК
Использовали планшетный ридер (EnSpire Equipment, Finland),
Библиографическая ссылка
Савинова Е.А., Каменева Л.В., Ершова Е.С., Умрюхин П.Е., Родионов И.В., Артюшин А.А., Краевая О.А., Трошин П.А., Вейко Н.Н., Костюк С.В. ВОДОРАСТВОРИМОЕ ПРОИЗВОДНОЕ ФУЛЛЕРЕНА С70 РЕГУЛИРУЕТ ТРАНСКРИПЦИЮ САТЕЛЛИТА III В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФИБРОБЛАСТАХ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2021. – № 10. – С. 22-26;URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=13286 (дата обращения: 13.10.2024).