Научный журнал
Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,578

АКТИВНОСТЬ МИКРОСОМАЛЬНЫХ РЕДУКТАЗ В КЛЕТКАХ РАКА ЯИЧНИКОВ, ИНТАКТНЫХ И ДЕФИЦИТНЫХ ПО КАСПАЗЕ-2

Федорова М.В. 1 Шестакова М.А. 2 Проскурнина Е.В. 3
1 ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора»
2 ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации
3 ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»
Рак яичников занимает лидирующую позицию среди причин смерти от гинекологических заболеваний. Гомеостаз активных форм кислорода и апоптоз являются ключевыми и патогенетически связанными звеньями канцерогенеза. Каспаза-2 обладает уникальным свойством запускать митохондриальный путь апоптоза в клетках. На мембранах митохондрий и эндоплазматического ретикулума располагаются цепи микросомального окисления цитохрома b5 и цитохрома Р450. Проведено исследование активности NADH-зависимой цитохром b5-редуктазы (CYB5R) и NADPH-зависимой цитохром Р450-редуктазы (CYPOR) в клеточной культуре рака яичников (Caov-4) в трех группах: интактные клетки (Wild Type), нокаутные клетки по гену каспазы-2 методом CRISPR/Cas9 и клетки, экспрессирующие малую шпилечную РНК, снижающую синтез каспазы-2, при помощи оригинальной методики люцигенин-активированной хемилюминесценции со стимулами NADH и NADPH. Стационарные уровни стимулированной хемилюминесценции АNADH и АNADPH отражают активность NADH-зависимой цитохром b5-редуктазы и NADPH-зависимой цитохром Р450-редуктазы соответственно. Показано, что отсутствие или снижение экспрессии гена каспазы-2 в клетках приводит к снижению активности цитохром b5-редуктазы в исследованных клетках рака яичника, что имеет практическое значение для изучения терапии и патогенеза злокачественных новообразований яичников.
рак яичников
каспаза-2
NADH-зависимая цитохром b5-редуктаза
NADPH-зависимая цитохром P450-редуктаза
активные формы кислорода
хемилюминесценция
1. Webb P.M., Jordan S.J. Epidemiology of epithelial ovarian cancer. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2017. Vol. 41. P. 3–14. DOI: 10.1016/j.bpobgyn.2016.08.006.
2. Sarmiento-Salinas F.L., Perez-Gonzalez A., Acosta-Casique A., Ix-Ballote A., Diaz A., Trevino S., Rosas-Murrieta N.H., Millan-Perez-Pena L., Maycotte P. Reactive oxygen species: Role in carcinogenesis, cancer cell signaling and tumor progression. Life Sci 2021. Vol. 284. P. 119942. DOI: 10.1016/j.lfs.2021.119942.
3. Carneiro B.A., El-Deiry W.S. Targeting apoptosis in cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol 2020. Vol. 17. No. 7. P. 395–417. DOI: 10.1038/s41571-020-0341-y.
4. Aksenova V.I., Bylino O.V., Zhivotovskii B.D., Lavrik I.N. [Caspase-2: what do we know today?]. Mol Biol (Mosk). 2013. Vol. 47. No. 2. P. 187. DOI:10.7868/s0026898413010023.
5. Terry M.R., Arya R., Mukhopadhyay A., Berrett K.C., Clair P.M., Witt B., Salama M.E., Bhutkar A., Oliver T.G. Caspase-2 impacts lung tumorigenesis and chemotherapy response in vivo. Cell Death Differ. 2015. Vol. 22. No. 5. P. 719–730. DOI: 10.1038/cdd.2014.159.
6. Lopez-Cruzan M., Sharma R., Tiwari M., Karbach S., Holstein D., Martin C.R., Lechleiter J.D., Herman B. Caspase-2 resides in the mitochondria and mediates apoptosis directly from the mitochondrial compartment. Cell Death Discov. 2016. Vol. 2. DOI: 10.1038/cddiscovery.2016.5.
7. Shalini S., Puccini J., Wilson C.H., Finnie J., Dorstyn L., Kumar S. Caspase-2 protects against oxidative stress in vivo. Oncogene. 2015. Vol. 34. No. 38. P. 4995–5002. DOI: 10.1038/onc.2014.413.
8. Tamm C., Zhivotovsky B., Ceccatelli S. Caspase-2 activation in neural stem cells undergoing oxidative stress-induced apoptosis. Apoptosis. 2008. Vol. 13. No. 3. P. 354–363. DOI: 10.1007/s10495-007-0172-7.
9. Kim B.M., Rode A.B., Han E.J., Hong I.S., Hong S.H. 5-Phenylselenyl- and 5-methylselenyl-methyl-2’-deoxyuridine induce oxidative stress, DNA damage, and caspase-2-dependent apoptosis in cancer cells. Apoptosis. 2012. Vol. 17. No. 2. P. 200–216. DOI: 10.1007/s10495-011-0665-2.
10. Moserova I., Truxova I., Garg A.D., Tomala J., Agostinis P., Cartron P.F., Vosahlikova S., Kovar M., Spisek R., Fucikova J. Caspase-2 and oxidative stress underlie the immunogenic potential of high hydrostatic pressure-induced cancer cell death. Oncoimmunology. 2017. Vol. 6. No. 1. P. e1258505. DOI: 10.1080/2162402X.2016.1258505.
11. Mishra R., Karande A.A. Endoplasmic reticulum stress-mediated activation of p38 MAPK, Caspase-2 and Caspase-8 leads to abrin-induced apoptosis. PLoS One. 2014. Vol. 9. No. 3. P. e92586. DOI: 10.1371/journal.pone.0092586.
12. Elahian F., Sepehrizadeh Z., Moghimi B., Mirzaei S.A. Human cytochrome b5 reductase: structure, function, and potential applications. Crit Rev Biotechnol .2014. Vol. 34. No. 2. P. 134–43. DOI: 10.3109/07388551.2012.732031.
13. Neve E.P., Nordling A., Andersson T.B., Hellman U., Diczfalusy U., Johansson I., Ingelman-Sundberg M. Amidoxime reductase system containing cytochrome b5 type B (CYB5B) and MOSC2 is of importance for lipid synthesis in adipocyte mitochondria. J Biol Chem. 2012. Vol. 287. No. 9. P. 6307–6317. DOI: 10.1074/jbc.M111.328237.
14. Samhan-Arias A.K.; Marques-da-Silva D., Yanamala N.; Gutierrez-Merino C. Stimulation and clustering of cytochrome b5 reductase in caveolin-rich lipid microdomains is an early event in oxidative stress-mediated apoptosis of cerebellar granule neurons. J Proteomics. 2012. Vol. 75. No. 10. P. 2934–2949. DOI: 10.1016/j.jprot.2011.12.007.
15. Shalini S., Kumar S. Caspase-2 and the oxidative stress response. Mol Cell Oncol. 2015. Vol. 2. No. 4. P. e1004956. DOI: 10.1080/23723556.2015.1004956.

Рак яичников занимает лидирующую позицию среди причин смерти от гинекологических заболеваний. Это связано с диагностированием на поздних стадиях заболевания, низким процентом пятилетней выживаемости и высоким процентом химиорезистентности [1]. Канцерогенез является сложным многокомпонентным процессом, в котором большое значение имеет нарушение гомеостаза активных форм кислорода (АФК) [2] и апоптоза, тесно связанных между собой в единой патогенетической цепи. Запуск апоптоза раковых клеток является целью различных схем терапии рака, например химиотерапии, лучевой терапии, иммунотерапии или таргетной терапии [3]. Резистентность опухоли к терапии зависит в том числе от способности клеток к индукции апоптоза.

Каспаза-2 обладает уникальными характеристиками, свойственными инициаторным, эффекторным и неапоптотическим каспазам. Она играет роль в запуске и усилении апоптоза, активируясь при воздействии генотоксического стресса, активации рецепторов смерти, стресса эндоплазматического ретикулума, метаболических изменений, тепловом шоке и воздействии ряда патогенов [4]. Каспаза-2 играет неапоптотическую роль в остановке клеточного цикла, стабильности генома и подавлении опухоли, действует как супрессор опухоли и участвует в химиотерапевтическом ответе [5].

Каспаза-2 обладает уникальным свойством запускать митохондриальный путь апоптоза посредством расщепления проапоптотического белка Bid и последующей пермеабилизацией внешней мембраны митохондрий. Каспаза-2 участвует в запуске апоптоза, вызванном митохондриальным оксидативным стрессом [6] и стрессом эндоплазматического ретикулума (ЭПР-стрессом).

На внешней мембране митохондрий и мембранах эндоплазматического ретикулума располагаются цепи микросомального окисления цитохрома b5 и цитохрома Р450. Не найдено работ, в которых была бы изучена возможная связь активности каспазы-2 и систем микросомального окисления, однако гипотетически такая связь может существовать на уровне кислородного метаболизма и регуляции апоптоза. Цель исследования – изучить активность микросомальных редуктаз цитохром b5-редуктазы (CYB5R) и цитохром З450-редуктазы (CYPOR) на культуре интактных и дефицитных по каспазе-2 клетках рака яичников при помощи оригинальной методики люцигенин-активированной хемилюминесценции со стимулами NADH и NADPH.

Материалы и методы исследования

Исследовали следующие культуры клеток рака яичников Caov-4 (ATCC, США): интактные (Wild Type, WT), нокаутные по гену каспазы-2 с помощью метода CRISPR/Cas9 (Cr) и экспрессирующие малую шпилечную РНК, снижающую синтез каспазы-2 (Sh). Клетки центрифугировали в течение 10 мин при 3000 g при комнатной температуре, далее осадок ресуспензировали раствором Хенкса, стабилизированном 2 мМ HEPES. Надосадочную жидкость использовали для контрольных экспериментов.

Оценку активности микросомальных редуктаз в культурах клеток проводили с помощью люцигенин-активированной хемилюминесценции на 12-канальном приборе Lum-1200 («ДИСофт», Россия). В пластиковую кювету вносили 800 мкл суспензии культуры клеток (количество клеток в пробе 800 000 ) и регистрировали базальную хемилюминесценцию в течение 3 мин при t = 37 °С. Далее добавляли 200 мкл люцигенина (динитрат 10,10’-диметил-9,9’-биакридиния, Sigma, США, конечная концентрация 200 мкМ) и продолжали запись сигнала 3–5 мин. Далее к пробам добавляли NADH или NADPH (Sigma, США) в конечной концентрации 100 мкМ и регистрировали ответ на стимулы в течение не менее 30 мин. Общий объем пробы в кювете составил 1,000 мл. Стационарные уровни стимулированной хемилюминесценции АNADH и АNADPH отражают активность NADH-зависимой цитохром b5-редуктазы и NADPH-зависимой цитохром Р450-редуктазы, соответственно. Эксперименты были проведены на двух образцах культур, каждую хемилюминограмму регистрировали в трех повторах.

Результаты исследования и их обсуждение

При добавлении стимулов к суспензии клеток Caov-4 WT уровень хемилюминесценции возрастал на порядок, и кинетика была близка к стационарной. Аналитический сигнал обусловлен прямым восстановлением люцигенина при помощи редуктаз с образованием супероксидного анион-радикала, к которому чувствителен люцигенин как хемилюминесцентный зонд. Таким образом, уровень хемилюминесценции отражает активность редуктаз. Для дикого типа активность цитохром b5-редуктазы была примерно в полтора-два раза выше активности цитохром Р450-редуктазы (рис. 1, а). В контрольном опыте с надосадочной жидкостью сигнал хемилюминесценции был близок к нулю (рис. 1, б).

В клетках Caov-4, дефицитных по каспазе-2, уровень NADH-стимулированной хемилюминесценции был ниже, чем в клетках WT (рис. 2, а), причем этот эффект не зависел от метода редактирования генома (рис. 2, б). Уровень NADPH-зависимой хемилюминесценции был практически одинаков в клетках WT, Sh и Cr.

Таким образом, в дефицитных по каспазе-2 клетках рака яичников снижена примерно в 1,5–2 раза активность CYB5R, но не CYPOR.

Накопленные данные свидетельствуют о том, что каспаза-2 связана как с митохондриально-опосредованным апоптозом, в том числе вызванным стрессом ЭПР, так и с метаболическими процессами, в том числе с метаболизмом активных форм кислорода.

missing image file

Рис. 1. Хемилюминограммы клеток дикого типа (а) и надосадочной жидкости (б) в присутствии люцигенина (Luc) NADH или NADPH; в качестве контроля к клеткам добавляли 10 мкл дистиллированной воды

missing image file

Рис. 2. Хемилюминограммы клеток Caov-4 (Sh), дефицитных по каспазе-2, в присутствии люцигенина (Luc) и NADH или NADPH (а); в качестве контроля к клеткам добавляли 10 мкл дистиллированной воды. Хемилюминограммы NADH-стимулированной хемилюминесценции для клеток Caov-4 дикого типа (WT) и с дефицитом по каспазе-2 (Cr и Sh) (б)

Каспаза-2, скорее всего, через факторы транскрипции FoxO, регулирует реакцию на оксидативный стресс in vivo. У мышей с нокаутом по каспазе-2 уровень окислительного стресса в белках был существенно выше, чем у животных дикого типа, а экспрессия генов транскрипционных противовоспалительных факторов FoxO1 и Nrf2 была снижена. Также при дефиците каспазы-2 не было усиления активности антиоксидантных ферментов глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы в ответ на обработку прооксидантом [7]. Таким образом, дефицит каспазы-2 приводит к усилению окислительного стресса потому, что не активируется механизм антиоксидантной защиты, что делает организм более уязвимым к экзогенным факторам и может частично объяснить более короткую продолжительность жизни мышей, дефицитных по каспазе-2 [7].

С другой стороны, АФК являются проапоптотическим фактором. Окислительный стресс приводит к накоплению белка p53 с последующей активацией каспазы-2, что, в свою очередь, инициирует апоптоз через митохондриальный путь в нейрональных стволовых клетках [8]. Ключевая роль активных форм кислорода в опосредованном каспазой-2 апоптозе подтверждается тем фактом, что антиоксиданты N-ацетилцистеин и кверцитин блокировали апоптоз и последовательную активацию каспазы-2 и каспазы-3 в раковых клетках [9]. В частности, может быть задействован путь АФК -> PERK (панкреатическая киназа эндоплазматического ретикулума) -> eIF2α (фактор инициации трансляции 2 эукариотического типа) -> каспаза-2 [10].

Стресс эндоплазматического ретикулума (накопление белков с нарушением укладки) приводит к активации проапоптотических белков BCL-2, BAX и BAK на внешней митохондриальной мембране, запуская таким образом апоптоз, и каспаза-2 участвует в этом, расщепляя BID в ответ на стресс эндоплазматического ретикулума, что приводит к потере потенциала на митохондриальной мембране; таким образом, ее ингибирование ее повышает устойчивость к апоптозу. Механизм апоптоза через BID и каспазу-2 реализуется также при окислительном стрессе. Таким образом, каспаза-2 участвует в передаче сигналов при ЭПР-индуцированном апоптозе для запуска митохондриального пути апоптоза [11].

Подведем итог: а) дефицит каспазы-2 способствует развитию окислительного стресса за счет ингибирования антиоксидантного ответа; б) окислительный стресс приводит к апоптозу, опосредованному каспазой-2; в) при стрессе эндоплазматического ретикулума каспаза-2 выступает как участник, передающий сигнал к митохондриальному апоптозу.

Цепь цитохрома Р450 располагается на мембранах эндоплазматического ретикулума. NADPH-зависимая цитохром P450-редуктаза (CYPOR) восстанавливает цитохром Р450, цитохром b5, гемоксигеназу, сквален-монооксигеназу, 7-дегидрохолестерол редуктазу, при этом образуются супероксидный анион-радикал и пероксид водорода. Цепь цитохрома b5 локализуется на мембранах эндоплазматического ретикулума, на внешней мембране митохондрий и мембранах комплекса Гольджи. NADH-зависимая цитохром b5-редуктаза (CYB5R) участвует в синтезе холестерина, элонгации жирных кислот, гидроксилировании ксенобиотиков и стероидных гормонов, поддерживает в восстановленном состоянии аскорбат и коэнзим Q10, защищая клетку от апоптоза [12]. Митохондриальная CYB5R локализуется на внешней мембране и в межмембранном пространстве. Она участвует, в частности, в синтезе липидов в митохондриях адипоцитов [13]. С другой стороны, CYB5R может действовать как прооксидантный фермент. Активация CYB5R, связанной с липидными рафтами, приводит к повышенной продукции супероксидного анион-радикала, что переводит апоптоз мозжечковых гранулярных клеток в необратимую фазу [14].

В литературе не найдено работ, изучающих взаимосвязь каспазы-2 и цитохром b5-редуктазы. Возникает ряд вопросов. Во-первых, в каком именно компартменте произошло снижение активности или концентрации CYB5R – митохондриальном, компартменте ЭПР или в комплексе Гольджи. При этом митохондриальная цитохром b5-редуктаза может быть как внешнемембранной, так и межмебранной, активность которой зависит от эффективности транслокации. Поскольку каспаза-2 тесно связана как с митохондриями, так и эндоплазматическим ретикулумом, ответ на этот вопрос следует искать специальными исследованиями, выделяя митохондрии и микросомальную фракцию из клеток, дефицитных по каспазе-2. Второй вопрос – за счет чего произошло снижение активности (или концентрации) CYB5R. Этот фермент является участником антиоксидантной защиты, и наши данные согласуются с ранее полученными результатами, свидетельствующими, что при дефиците каспазы-2 снижена активация антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы и глутатион-пероксидазы в ответ на окислительный стресс [15]. Каспаза-2 и CYB5R являются многофункциональными ферментами, участвующими в метаболизме активных форм кислорода, других метаболических процессах (обмен липидов и углеводов), в регуляции апоптоза. В целом они действуют в разных направлениях – активация каспазы-2 усиливает апоптоз и окислительный стресс, активация CYB5R противодействует апоптозу и окислительному стрессу. Если снижение активности каспазы-2 приводит к снижению активности CYB5R, возможно, эти ферменты связаны единой регуляцией, механизм которой предстоит выяснить.

Заключение

Отсутствие или снижение экспрессии гена каспазы-2 приводит к снижению активности цитохром b5-редуктазы в клетках рака яичника, что позволяет выдвинуть гипотезу о том, что эти ферменты связаны через пока еще невыясненные сигнальные пути. Предстоит определить, в каком пуле CYBR5 и по какому механизму произошло снижение активности. Поскольку в аспекте апоптоза и окислительного стресса каспаза-2 и CYB5R действуют разнонаправленно, практическое значение заключается в том, что при разработке методов терапии рака резистентных опухолей нужно учитывать влияние обоих ферментов.

Авторы благодарят канд. биол. наук Г.С. Копеину за предоставленные образцы клеток и ценные советы при обсуждении результатов.


Библиографическая ссылка

Федорова М.В., Шестакова М.А., Проскурнина Е.В. АКТИВНОСТЬ МИКРОСОМАЛЬНЫХ РЕДУКТАЗ В КЛЕТКАХ РАКА ЯИЧНИКОВ, ИНТАКТНЫХ И ДЕФИЦИТНЫХ ПО КАСПАЗЕ-2 // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2022. – № 6. – С. 58-62;
URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=13398 (дата обращения: 28.01.2023).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.685